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金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是一种重要的人畜共患病病原菌,荚膜和外毒素是其重要的致病因子,本研究以这两类抗原为靶点寻找有效的免疫学手段以替代抗生素防治感染性疾病。针对奶牛乳房炎,本课题组前期研究发现,特异性卵黄抗体(IgY)具有显著的治疗作用,但是针对荚膜及外毒素的IgY尚未研究。针对人类金黄色葡萄球菌感染,目前尚无有效的疫苗。而糖工程是生产多糖-蛋白生物结合疫苗的全新技术,通过这一手段可将金黄色葡萄球菌荚膜多糖和外毒素交联制成多价疫苗,并最大程度保护其抗原决定簇。本研究考察了荚膜-毒素生物结合疫苗在人类重要感染疾病模型中的预防作用。(1)针对奶牛乳房炎,本研究采用5型(CP5)、8型(CP8)和336型(无荚膜)金黄色葡萄球菌全菌疫苗免疫蛋鸡后分离纯化获得IgY (IgY-T5, IgY-T8, IgY-T336),纯度达到80%。ELISA检测结果表明,IgY-T5、 IgY-T8及IgY-T336特异性地结合相应血清型的抗原,三者间无交叉反应,而且都不与酸奶发酵所用保加利亚杆菌结合,故对酸奶生产无不良影响。体外抑菌实验表明,在液体培养基中生长8h期间,15mg/ml的IgY-T5和IgY-T8不能抑制T5和T8荚膜金黄色葡萄球菌的生长,而15mg/ml的IgY-T336可显著抑制(4～8h)T5、T8和T336菌的生长,抑制强度约为2个Log单位,提示抑菌作用主要依赖于IgY与表面蛋白而非荚膜的结合。细菌侵袭实验表明,5mg/ml的IgY-T5, IgY-T8, IgY-T336能够分别抑制5,8和336型金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)的侵袭。以上结果表明,针对荚膜的特异性卵黄抗体在奶牛乳房炎的防治中具有潜在应用价值。(2)金黄色葡萄球菌外毒素也是奶牛乳房炎的一个主要致病因子,本研究分离金黄色葡萄球菌V8及RN6390的总外毒素,通过免疫蛋鸡获得特异性抗体(IgY-toxins)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验表明,IgY-toxins可有效阻断金黄色葡萄球菌外毒素对MAC-T细胞及嗜中性粒细胞的裂解,此保护作用呈现浓度依赖性。本实验中用表达GFP的336型金黄色葡萄球菌菌株RN6390来评价IgY对金黄色葡萄球菌入侵MAC-T细胞的阻断作用。通过荧光显微镜观察,5mg/ml的IgY-T336可明显阻断RN6390对MAC-T细胞的侵袭,5mg/ml的IgY-T336和0.5mg/ml的IgY-toxins联合使用时能够更好地阻断金黄色葡萄球菌侵袭MAC-T细胞,而且细胞生长形态大大改善。临床型乳房炎实验表明,三种荚膜特异性IgY联合治疗(IgY-T5,IgY-T8及IgY-T336各20mg)5天后,患病奶牛乳液中体细胞计数(SCC)明显降低,使用20mg的IgY-toxins可达到同等效果。如果将三种荚膜特异性IgY(每种20mg)和IgY-toxins (20mg)联合使用两天后,体细胞数就得到显著降低,SCC数降至1～2×104cells/ml,并一直保持到实验的第6天,且最终SCC水平低于抗荚膜或者毒素IgY单独治疗组,疗效与青霉素(100mg)治疗组相当。通过感观评价治疗后第6天奶样发现,所有4个治疗组奶样凝块水平都明显低于对照组,组间无差异。3个IgY治疗组不能显著降低奶样中金黄色葡萄球菌数。结合(1),以上结果提示抗荚膜和毒素特异性IgY联合使用比单独使用更有效,IgY在乳房炎的治疗中应该着眼于中和毒素和抵御金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞,而非抑菌作用。(3)针对人类的感染疾病,体外功能性实验表明,荚膜多糖-毒素生物结合疫苗免疫所得抗体αCP5-Epa、 αCP5-Hla、αCP8-Epa能特异性地调理5型和8型金黄色葡萄球菌被嗜中性粒细胞杀伤, αCP5-Hla还可有效中和α-毒素的细胞毒作用。提示,糖工程技术可在大肠杆菌中成功表达具有免疫原性和生物学功能的金黄色葡萄球菌结合疫苗。(4)金黄色葡萄球菌菌血症是临床上很常见的感染,本研究通过小鼠菌血症模型研究发现,主动免疫0.2μg CP5-2μg Epa可有效预防小鼠菌血症及体重下降、肾脏脓肿。被动免疫1mg的α CP5-Epa可有效预防Reynolds、 USA100及USA200所致的小鼠菌血症。主动免疫2(μg CP5-20μg Hla或被动免疫1mg的α CP5-Hla有效预防小鼠菌血症。对于CP8菌株,主动免疫0.2μg CP8-2μg Epa可预防Reynolds (CP8+)所致菌血症,但是对体重下降、肾脏脓肿没有显著的保护作用。被动免疫1mg的α CP8-Epa可显著预防Reynolds (CP8+)引起的小鼠菌血症。提示CP5和CP8疫苗对系统性感染-菌血症的预防切实有效。(5)金黄色葡萄球菌肺炎也是临床上非常严重的感染,致死率很高。本研究通过小鼠模型研究发现,主动免疫2μg CP5-20μg Hla可有效预防由Newman (CP5+)以及两株MRSA菌株LAC(CP-)和ST80(CP8+)所引起的致死性肺炎,同时可有效预防Reynolds(CP5+)所致小鼠菌血症。小鼠免疫CP5-Hla后,利用单克隆抗体将CD4+T细胞和CD8+T细胞剔除,其存活率与不剔除时无显著差异。提示,T细胞在CP5-Hla主动免疫保护过程中不起作用。被动免疫1mg α CP5-Hla可有效预防小鼠的菌血症,而且能够显著延长小鼠在致死性肺炎模型中的存活时间,但是不能提高存活率。分别在攻毒前24h和2h被动免疫1mg的α CP5-Hla可显著预防小鼠死于致死性肺炎。(6)金黄色葡萄球菌也能在医疗器械,如导管上定殖,甚至形成生物被膜,从而导致感染。在导管介导的大鼠心内膜炎模型中,α CP5-Hla不能起到稳定的保护作用,对模型相关的心脏瓣膜赘生物的形成、菌血症水平、体重指数、肾脏细菌水平及存活率只是呈现一定的保护趋势。抗体剂量需要进一步摸索。以上结果表明,金黄色葡萄球菌荚膜多糖和外毒素是免疫防治策略很好的靶点。因此,针对这两个靶点的IgY可有效治疗临床型金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎。利用糖工程方法生产的荚膜-毒素生物结合疫苗可有效预防小鼠菌血症(系统性感染)、肺炎(局部性感染),而且对心内膜炎(外科介入相关感染)有一定的保护趋势。针对金黄色葡萄球菌荚膜及外毒素的免疫策略在人畜共患病的防治中具有很好的应用潜力。