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目的:本研究通过盲肠结扎穿孔术（Cecal Ligation and Puncture,CLP）方法诱导不同时长的脓毒症,运用流式细胞术分析和观察造模后小鼠多器官内免疫细胞比例变化情况。确定早、晚期分期节点后分别提取脓毒症早、晚期小鼠的脾脏RNA进行转录组测序,筛选出脓毒症早、晚期脾脏细胞中的差异基因,进一步阐述脓毒症不同阶段脾脏免疫反应改变的机制。方法:采用CLP构建脓毒症动物模型,在距小鼠盲肠末端1cm处进行结扎,22G针头穿刺两次,轻轻挤出些许肠内容物后将盲肠放回腹腔。通过观察小鼠术后表现来确定造模方法,脓毒症小鼠10天生存率约为50%。通过对假手术组（Sham组）和CLP术后多个时间点（0.5d、1d、2d、4d、6d和10d）组小鼠的骨髓、脾脏、外周血细胞中免疫细胞如T细胞、NK细胞及MDSCs进行流式细胞术分析,通过观察上述免疫细胞的比例变化,来区分CLP术后脓毒症早、晚期时间。将Sham组、脓毒症早期组和脓毒症晚期组小鼠脾脏提取RNA,进行转录组测序分析后,筛选出早、晚期脓毒症小鼠脾脏中差异表达的关键基因及其作用通路。结果:1.本研究中通过CLP建立的脓毒症小鼠模型10天死亡率为50%。从外在表现看,经CLP处理的小鼠具有脓毒症特征:毛发湿润,少动,对光、声敏感度下降,躲避反射减弱或消失。将死亡小鼠进行解剖时发现术后短期内死亡的小鼠腹部膨大,大量腹腔积液,内含恶臭脓液,且存在肠管粘连,而脓毒症发展一定时间后死亡的小鼠盲肠末端处多形成炎症性包裹,腹腔内有少量积液。2.Sham组和脓毒症各组小鼠的不同器官中骨髓源性抑制细胞（Myeloid derived Suppressor cells,MDSCs）、T淋巴细胞和NK细胞的分布情况:（1）MDSCs的分布情况:在骨髓中,CLP 0.5d~2d表型为CD11b+Gr-1+的细胞较Sham组显著减少（p<0.05）,CLP 4d、6d组与Sham组比较无显著性差异,CLP 10d组较Sham组上升,差异具有统计学意义（p<0.05）;（2）T淋巴细胞分布情况:在脾脏中,与Sham组相比,CD3+总T淋巴细胞在CLP 0.5d~1d时升高,CLP4d~10d明显低于Sham（p<0.05）;在外周血中,CLP0.5d~2d时段均与Sham组没有明显差异,CLP4d~10d组外周血中的CD3+T细胞明显下降,CLP10d最低（p<0.05）。与Sham组相比,脾脏中的CD4+T细胞在CLP 0.5d时出现了一过性的上升（p<0.05）,CLP 1d时开始持续回落,CLP10d下降最明显（p<0.05）。CD8+T细胞的比例变化较小,CLP 0.5d至CLP 2d与Sham组相比均无显著差异,但从CLP 4d开始下降（p<0.05）,在CLP 10d时最明显。外周血中CD4+和CD8+T细胞所占比例在CLP 0.5d~2d时与Sham组相比均无明显变化,在CLP 4d时开始出现显著下降（p<0.05）,两者均在CLP10d时下降最多。（3）NK细胞分布情况:脾脏中NK细胞比例在CLP0.5d-1d组较Sham组显著升高（p<0.05）,术后10d组下降至1.526%（p<0.05）;外周血中NK细胞比例在CLP0.5d,1d和2d时较Sham组明显升高（p<0.05）,CLP4d开始和Sham组无明显差异。3.不同时期脓毒症小鼠脾脏细胞转录组表达差异:与Sham组对比,CLP1d组（脓毒症早期组）的脾脏组织中筛选出661个差异表达基因,CLP10d组（脓毒症晚期组）筛选出836个差异表达基因,从中挑选出差异表达基因的蛋白互作网络中Degree值前20个的node作为Hub基因。CLP1d与Sham组脾脏细胞转录组相比产生的Hub基因有Il6、Il10、Fn1、Egf、Il2、Cxcl1等;CLP10d与Sham组脾脏细胞转录组相比筛选出的Hub基因有Itgam、Itgax、Ccr7、Foxp3、Ccl5、Mmp9等。分别对两组的Hub基因进行功能富集分析发现:脓毒症早期的Hub基因主要富集在中性粒细胞和单核细胞向病灶部位迁移上、单核/巨噬细胞大量激活导致过度免疫反应、多种炎症因子表达表达上调。脓毒症晚期Hub基因主要表型为Th1、Th2和Th17淋巴细胞向病灶迁移发生阻碍,机体产生免疫耐受,对外界刺激应答减弱,淋巴细胞处于功能失调状态。结论:1.运用CLP进行动物脓毒症造模的实验方式可以模拟机体免疫亢进和免疫抑制两种状态。2.根据脓毒症各期不同器官中免疫细胞的流式结果,我们分析得到:在脓毒症早期,小鼠脾脏及外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及NK细胞比例均增多,骨髓中MDSCs的比例减少;在脓毒症晚期,小鼠脾脏及外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及NK细胞比例明显减少,而骨髓中MDSCs的比例增加。3.转录组测序分析的结果说明在脓毒症早期小鼠的脾脏中,中性粒细胞和单核细胞被大量激活和趋化,而在脓毒症晚期小鼠脾脏中,这些细胞的迁移发生障碍,机体出现免疫耐受,对外界刺激应答减弱。同时得到了可进一步进行脓毒症免疫抑制病理生理机制研究的生物标志。