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猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的,严重危害养猪产业的疾病。自上世纪八十年代末该病毒在美国西部首次被发现,几乎同一时间欧洲许多国家也检测出阳性PRRSV,之后随全球贸易遍布各大洲国家。当前预防该病的主流措施是弱毒和灭活疫苗接种,但由于灭活苗免疫效果不佳,弱毒苗存在极大散毒风险,因此开发其他药物可能对防治该病具有深远意义。中药抗病毒历史悠久,对中国几千年的文明传承具有深远意义。由于猪肺泡巨噬细胞是PRRSV天然靶细胞,所以选择该细胞研究板蓝根多糖体外抗PRRSV作用机理更具现实意义,而猪原代PAM细胞制作成本高昂且不易获取,用于研究TLRs和细胞因子的动态表达容易造成大量浪费,因此将成功转染并稳定表达CD163受体的永生猪肺泡巨噬细胞3D4/21/CD163作为研究对象进行本试验更为适宜。本文从板蓝根中提取具有抗病毒活性的板蓝根多糖（Radix Isatidis Polysaccharide,IRPS）进行体外抗病毒试验,将IRPS以抗病毒试验筛选的最佳浓度和作用方式作用于PRRSV JXA1感染3D4/21/CD163细胞来检测药物对TLRs及其下游相关细胞因子表达的影响,最后根据上述试验结果验证TLRs在IRPS抑制PRRSV JXA1体外增殖的功能。试验分为四个部分,如下所述:试验一板蓝根多糖对PRRSV JXA1体外增殖的影响。本试验用稳定表达CD163的永生化猪传代肺泡巨噬细胞（3D4/21/CD163）作为靶细胞来研究IRPS抑制PRRSV JXA1感染的最佳药物浓度、给药方式,以及药物阻断病毒复制的环节。根据IRPS与PRRSV JXA1作用细胞的先后顺序将给药方式分为预防组、直接杀灭组和治疗组来研究IRPS的最佳用药浓度和给药方式;根据IRPS对PRRSV JXA1的吸附、侵入和胞内增殖环节的影响来探究IRPS抑制PRRSV JXA1复制的环节。以最佳用药浓度、给药方式和阻断复制环节共同作用细胞来验证药物最终的抗PRRSV效果。结果显示:IRPS抑制PRRSV-JXA1增殖的最佳剂量为0.015625mg/m L,最佳给药方式和最佳阻断环节为预防作用和吸附环节,分别使病毒载量减少了91.34%（P＜0.0001）和88.83%（P＜0.0001）,0.015625mg/m L的IRPS以预防的给药方式作用于病毒的吸附环节效果最佳,最终使病毒载量下降了94.97%。试验二IRPS对PRRSV JXA1感染3D4/21/CD163细胞TLRs转录和翻译水平的影响。试验分为细胞对照组、给药组和病毒对照组,所筛选的最佳给药剂量的IRPS以预防和抗吸附的作用方式给药。采用荧光定量PCR和Western blotting分别检测病毒感染开始6h、12h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h TLRs的转录和翻译水平。结果显示PRRSV JXA1分别促进TLR3、TLR4、TLR7、TLR9,3个、4个、0个、5个时间点转录,其他时间点则表现为抑制效果,从整体结果看IRPS双向调节了TLRs的转录;Western blotting检测结果结合蛋白灰度分析可见IRPS对TLR3、TLR4和TLR9的翻译整体呈上调作用。结论:IRPS双向调节TLRs m RNA转录水平,促进TLRs蛋白翻译水平。试验三IRPS对感染PRRSV JXA1的3D4/21/CD163细胞分泌细胞因子的影响。试验分细胞对照组、药物抗病毒组和病毒对照组,用0.015625mg/m L的IRPS以预防的方式作用于PRRSV JXA1对靶细胞的吸附环节,在药物作用第6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h收集细胞,通过相对荧光定量PCR检测细胞因子转录水平;收集上清液,使用ELISA试剂盒检测不同时间点细胞因子的翻译水平。结果显示:药物对检测的四种炎性因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）的28个时间点中有27个展示出不同程度的双向调节作用;对检测的三种干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）21个时间点中有18个表现出双向调节作用;对检测的免疫抑制因子（IL-10）7个时间点均表现双向调节作用。IRPS促进病毒清除因子（IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α）的表达;抑制部分炎症因子（IL-1β、IL-8）的过度表达;对免疫抑制因子（IL-10）前期的表达为促进效果,抑制其后期表达。整体上IRPS对感染PRRSV JXA1的3D4/21/CD163细胞分泌细胞因子具有显著双向调节作用。试验四TLR4和CD163在IRPS抗PRRSV JXA1过程中功能的验证。试验使用CCK8法检测TLR4抑制剂TAK-242的最大安全浓度;使用Western blotting检测TLR4下游关键分子NF-κB的蛋白表达水平确定以TAK-242抑制TLR4/NF-κB最佳浓度;使用最佳浓度的TAK-242作用于细胞,通过荧光定量PCR检测TLR4/NF-κB被阻断时IRPS对PRRSV JXA1载量的影响;使用Western blotting检测IRPS对CD163蛋白表达的影响。NF-κB蛋白灰度结果显示40μmol/L的TAK-242能够有效阻断TLR4/NF-κB通路,且不会对细胞造成毒害作用。当TLR4/NF-κB途径被阻断时,PRRSV的拷贝数显著增加（P＜0.001）,这说明该途径途径是机体抵抗PRRSV感染的通路之一。当TLR4信号通路未受到抑制时IRPS有较好的抗PRRSV作用（P＜0.0001）,而在TLR4/NF-κB信号通路被阻断时IRPS不仅失去抗PRRSV作用反而促进了PRRSV的增殖,这说明该途径同样是IRPS体外抗PRRSV增殖的关键途径。CD163蛋白翻译水平检测结果显示:IRPS相对于病毒对照促进了CD163蛋白翻译,这可能是TLRs被阻断时IRPS促进PRRSV复制的原因之一。