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目的1.水动力法构建HBV持续复制型小鼠模型及其鉴定2.利用Cre-loxP重组系统建立诱导型HBV表达系统并制备诱导型HBV转基因小鼠方法1.HBV持续复制型小鼠模型的建立(1)HBV1.3-56质粒的鉴定：含1.3拷贝HBV基因组(血清型adw,基因型B)的质粒HBV1.3-56(本实验室保管)酶切及测序鉴定后转染Huh7肝癌细胞系,ELISA方法检测HBsAg.HBeAg的分泌表达水平；Southern Blot检测HBV复制；Northern Blot检测HBV转录。(2)HBV持续复制型小鼠模型的建立：利用水动力法将HBV1.3-56质粒、阳性对照1.3HBV质粒(血清型ayw,基因型DE重组型)经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,注射后每周收集小鼠血清至第16周,ELISA检测HBsAg.HBeAg表达水平；注射后第3天、7天、10天、14天和19天处死部分小鼠取肝脏,Southern Blot检测HBV复制水平, Northern Blot检测HBV转录水平。2.诱导型HBV表达系统的建立及其转基因小鼠的制备(1)诱导型HBV表达系统的构建：基于Cre-loxP重组系统和内含子(]ntron)剪接系统,将五种不同来源的转录终止信号序列以及由HBVEnhancerⅡ/Cp启动子启动的红色荧光蛋白DsRed基因插入S基因区,两侧加入同方向loxP识别位点和Intron剪接位点序列,构建得到phBV-intron-RFP(HnR)质粒；该质粒只有在Cre重组酶催化剪切loxp位点之间的插入序列后,才可转录出HBV前基因组RNA(pgPNA),从而建立诱导型HBV表达系统(此部分工作主要由本课题组刘伟博士完成)。(2)诱导型HBV表达系统的鉴定：酶切、测序鉴定HnR,然后在细胞水平和动物水平上,分为诱导组(HnR/pShuttle-Cre)、未诱导组(HnR/pShuttle)和阳性对照组(HBV1.3-56)分别验证Cre重组酶诱导前后HBV在蛋白、RNA及DNA三个层次上的复制表达情况。(3)HnR转基因小鼠的建立：HnR质粒经KpnI和PciI双酶切得到线性化DNA片段,通过将该DNA片段显微注射C57/CBA杂合一代受精卵原核细胞的方法获得转基因首建鼠,经过野生型C57BL/6小鼠交配和同窝交配同时每代于仔鼠2-3周龄时剪尾抽提小鼠基因组,PCR筛选阳性小鼠,得到纯合的HnR转基因小鼠。结果1.HBV持续复制型小鼠模型的建立(1) HBV1.3-56质粒的鉴定结果：HBV1.3-56经酶切鉴定后,结果与预期相符；HBV1.3-56脂质体转染Huh7细胞72h后收集细胞培养上清,ELISA方法检测HBsAg、HBeAgle均为阳性,Southern Blot检测到HBV DNA复制,Northern Blot检测到HBV RNA转录。(2) HBV持续复制型小鼠模型的鉴定结果：水动力法注射HBV1.3-56小鼠的血清中HBsAg在注射后4周时阳性率100%,注射后16周时阳性率仍为60%,HBeAg的检测值虽然较低,但持续时间与HBsAg基本一致；对照组1.3HBV(ayw)小鼠血清中HBsAg持续仅一周即消失。Southern Blot检测结果显示在注射后的19天内,HBV复制能力逐渐增强。Northern Blot检测结果显示在注射后的19天内,HBV转录水平逐渐变弱,高峰出现第10天。HBV在小鼠肝脏中的复制和转录水平随时间的变化不完全同步。2.诱导型HBV表达系统及其诱导性HBV转基因小鼠的建立(1)诱导型HBV质粒系统的鉴定：质粒系统中HnR质粒和pShuttle-Cre经酶切及测序鉴定后,结果与预期相符。在细胞水平上验证该质粒系统,可见未诱导组(HnR/pShuttle)红色荧光蛋白表达,诱导组(HnR/pShuttle-Cre)几乎没有红色荧光蛋白表达；ELISA检测上清中HBsAg,未诱导组为阴性结果,诱导组与阳性对照组为阳性结果；HBeAg的表达由于不受插入序列影响,因此未诱导组与诱导组、阳性对照组的HBeAg检测结果均为阳性；Southern Blot和Northern Blot分别检测到诱导组与阳性对照组中HBV复制中间体DNA和转录的RNA,而未诱导组均为阴性；RT-PCR结果显示诱导组确实发生预期重组。在动物水平上验证该质粒系统,注射后第4天ELISA检测各组小鼠血清中HBsAg,未诱导组为阴性结果,诱导组与阳性对照组为阳性结果；HBeAg的表达由于不受插入序列影响,因此未诱导组与诱导组、阳性对照组的HBeAg检测结果均为阳性；Southern Blot和Northern Blot分别检测到诱导组与阳性对照组中HBV复制中间体DNA和转录的RNA,而未诱导组均为阴性；RT-PCR结果显示诱导组确实发生预期重组。(2)HnR转基因小鼠的建立：获得HnR转基因首建鼠后,首先与野生型C57BL/6小鼠交配,PCR鉴定阳性仔鼠,连续交配7代后,阳性仔鼠进行同窝交配,得到纯合HnR转基因小鼠。结论1.通过高压水动力法建立了HBV持续复制型小鼠模型,通过检测发现HBV在该小鼠模型体内的表达时间相对较长,ELISA检测HBeAg可持续近四个月,优于此前文献报道的类似模型。2.成功建立了诱导型HBV表达系统,并且在细胞水平和动物水平上均显示可行性,通过显微注射制备HnR转基因小鼠,通过回交和同窝交配得到纯合转基因小鼠。