水稻是重要的粮食作物之一,全国有60%人口以稻米为主食,随着人们生活水平的提高,对稻米品质要求日渐提高。重金属镉（Cd）是一种非必需元素,对动植物生长发育有毒害作用。工业废水污染、矿产废弃物排放、以及矿质肥料的使用,造成了一些农田Cd含量超标,进而造成稻米Cd超标,严重危害人民健康。为此,国家已采用多种土壤修复措施降低土壤Cd污染的影响,但进展较为缓慢。为实现镉污染土壤中的水稻安全生产,本研究采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术创建了OsLCT1和OsNramp5的水稻突变株系,以期阻止Cd的吸收和转运。在此基础上,还对其中两个OsLCT1突变体（lct1x1和lct1x3）和两个OsNramp5突变体（nramp5×7和nramp5×9）,通过盆栽和田间试验,进行了稻谷镉积累和农艺性状评估,对四个OsNramp5突变体（nramp5×7+1,nramp5×7-2,nramp5×9+1和nramp5×9-33）通过水培进行了生理性状和转录组分析。主要结果总结如下:1.利用CRSPR/Cas9技术快速创建了多种类型的OsLCT1和OsNramp5水稻突变株系。利用本实验室改良的CRISPR-S载体对OsLCT1的第1、3外显子和OsNramp5的第7、9外显子进行靶向突变,HRM筛选和Sanger测序,最终分别获得15份oslct1x1,70份oslct1x3,1份osnramp5x7和4份osnramp5x9突变体。其中约2/3的oslct1x1 T₀突变株为杂合型,1/3为双等位突变型;而oslct1x3 T₀单株杂合型、双等位突变和纯合型突变分别约11.4%,62.9%和25.7%。突变类型包括从1 bp⁴9 bp不同长度插入或缺失,以单碱基插入或缺失为主。2.试验的oslct1（lct1x1和lct1x3）和osnramp5（nramp5x7+1和nramp5x9-33）突变系稻米Cd含量均显著降低,但降低幅度不同。种植在土壤镉含量约为0.9 mg/kg的田间试点时,lct1x1突变体的稻谷镉含量约为野生型亲本的40%（0.17 mg/kg）,低于食品中污染物限量值的国家标准（0.20 mg/kg）,而突变体lct1x3的镉含量约为野生型亲本的80%。在土壤Cd含量约为0.85 mg/kg和0.90mg/kg的田间试点种植时,突变体lct1x3的镉含量分别为0.28 mg/kg和0.37 mg/kg,高于国家安全标准。两个OsNramp5突变体在上述镉污染大田和镉处理（+2 mg/kg Cd）盆栽试验中,稻谷镉含量均小于0.06 mg/kg。不同的nramp5突变体植株生长表现不同,突变体nramp5x7+1的长势和产量正常,而nramp5x9-33生长受到严重影响。此项研究表明,lct1x1可种植于镉污染较轻的土壤,而nramp5x7则可在镉污染高于国家土壤环境质量标准三级（1.0 mg/kg）的土壤中生产出安全的稻米。3.OsNramp5在Cd和Mn的吸收和运输中扮演重要角色,突变可影响Cd和Mn的吸收和转运。在含5μM Cd的营养液中培养3周,osnramp5的4个突变体（nramp5x7+1,nramp5x7-2,nramp5x9+1和nramp5x9-33）茎叶和根中镉含量比野生型分别降低了约70.3%⁷4.4%和71.4%⁷7.6%,67.4%⁸0.5%和69.8%⁷6.7%,60.3%⁷7.7%和75.2%⁸2.4%,以及56.8%⁷7.8%和63.2%⁶6.4%;在Mn浓度过量（140μM）和无Cd处理营养液中,osnramp5的4突变体茎叶中Mn含量比野生型都降低了约94%,根中降低了80.21%⁹0.89%。4.四个不同的osnramp5突变体长势不同。在含0.35μMMn的营养液中培养三周,突变体nramp5x7+1表型与野生型生长状态相似,茎叶和根的鲜重与野生型无显著差异,然而nramp5x7-2,nramp5x9+1和nramp5x9-33的茎叶和根鲜重分别降低了约36.5%和33.1%,27.6%和18%,16.1%和5.8%;在含7μM Mn的营养液中培养三周,相对于野生型,突变体nramp5x7+1茎叶和根的鲜重分别升高了12.2%和10.0%,而nramp5x7-2的茎叶和根鲜重分别降低了约21.6%和15.5%,nramp5x9+1和nramp5x9-33的茎叶鲜重分别降低了约12.6%和18%,然而根根鲜重分别升高了约6.6%和0.8%;在含140μM Mn的营养液中培养三周,相对于野生型,突变体nramp5x7+1,nramp5x9+1和nramp5x9-33中茎叶和根的鲜重分别升高了27.5%和15.4%,4.1%和8.0%,7.8%和0.1%,而nramp5x7-2的茎叶和根鲜重分别降低了约6.4%和12.2%。5.突变体nramp5x7+1可能存在加强版氧化还原平衡系统。osnramp5突变体和野生型在7μM Mn的营养液中培养三周,转录组差异表达基因富集分析表明3个突变体（nramp5x7+1,nramp5x7-2和nramp5x9+1）中海藻糖、二糖和寡糖的生物合成和代谢过程相关基因表达量上调。相对于突变体nramp5x9+1,突变体nramp5x7+1叶和根中氧化还原平衡过程相关基因表达量上调,韦恩图差异基因分析表明nramp5x7+1中部分响应胁迫的基因与野生型和其他两个突变体有显著差异,说明更优的氧化还原平衡系统的参与可能使突变体nramp5x7+1更好地应对低锰和镉胁迫处理。综上所述,我们通过基因编辑技术CRISPR/Cas9创建了OsLCT1和OsNramp5两个基因的突变体,并进行了盆栽和田间试验稻谷镉积累和农艺性状评估,结果表明osnramp5突变体糙米中镉含量降低幅度大于oslct1x1突变体,其中只有突变体nramp5x7+1生长正常,可应用于水稻安全生产。对osnramp5不同突变体进行生理遗传和转录组水平分析表明,突变体nramp5x7+1可能因更优的氧化还原平衡系统使其OsNramp5部分功能丧失的情况下,依然可以生长良好,说明该突变体不仅能应用于镉污染土壤安全生产,且在高锰污染土壤中表现更佳。同时,本研究对OsLCT1和OsNramp5基因的遗传分析,对于理解水稻的金属转运和调控具有重要意义。