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研究背景及研究目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。《2015年中国癌症统计》显示,乳腺癌的发病率在所有女性新发肿瘤中已占据15%。乳腺癌的侵袭转移是影响乳腺癌患者生存率的重要原因。因此,寻找乳腺癌新的标志物以及开发靶向治疗药物具有重要的意义。microRNA(miRNA,miR)是人类细胞中表达丰富的一类非编码RNA。miRNA可以使mRNA降解或抑制翻译,引发RNA沉默。近年来,研究发现,已知的人类一半miRNA与癌症有关。miRNA可沉默抑癌基因或原癌基因的转录,因此可作为癌基因或抑癌基因发挥作用,从而参与肿瘤的发生发展。在乳腺癌方面,miRNA与乳腺癌的早期诊断、治疗、预后预测及药物治疗靶点的开发等都有密切的关系。miR-301b-3p是近年来新发现的miRNA,其在结肠癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等已有初步的研究。目前,miR-301b-3p在乳腺癌中的作用报道甚少。Chang等使用深度测序技术分析24例三阴性乳腺癌组织和14例相邻正常乳腺癌的miRNA表达差异,随后进行定量逆转录PCR验证miRNA表达水平,鉴定出三阴性乳腺癌中miR-301b-130b簇表达上调。在我们课题组在前期工作中,miRNA芯片结果显示miR-301b-3p在MAP2K4(丝裂原活化蛋白激酶激酶4)过表达的乳腺癌细胞中表达上调,而MAP2K4已被认为是促癌因子。所以,结合深度测序和miRNA芯片结果,我们推测miR-301b-3p是候选癌基因,在乳腺癌中的发生发展中可能也起到一定促进作用。因此,本课题主要研究在干扰miR-301b-3p后乳腺癌细胞在细胞增殖和细胞侵袭这两方面的改变及其初步分子机制,为后续进行更深入的研究提供依据。研究方法应用inhibitor瞬时转染技术干扰miR-301b-3p在乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR3中的表达水平,通过实时荧光定量PCR测定瞬转效率。MTT、EdU、Transwell、Boyden、划痕实验等分析miR-301b-3p对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。免疫印迹法检测相关通路分子的表达,从而初步探讨miR-301b-3p在乳腺癌中的作用机制。研究结果1、实时荧光定量PCR测定瞬转inhibitor后乳腺癌细胞MDA-MB-231和SKBR3中miR-301b-3p的表达量,两株细胞中miR-301b-3p干扰组较空白对照组表达量明显降低(分别是P=0.001,P=0.001)。2、miR-301b-3p在乳腺癌中促进癌细胞增殖、转移及其分子机制。2.1瞬转miR-301b-3pinhibitor后,MTT细胞增殖实验显示,与空白对照组相比,干扰miR-301b-3p后显著抑制MDA-MB-231细胞和SKBR3细胞的增殖,从第二天开始,P均小于0.05;2.2 EdU 实验显示,MDA-MB-231 细胞和 SKBR3 细胞瞬转 miR-301b-3p inhibitor后,与空白对照组相比,实验组处于S期的比例下降,细胞增殖能力减弱(P=0.022;P=0.002);2.3划痕实验、Transwell和Boyden实验检测干扰miR-301b-3p后,细胞迁移和侵袭能力减弱,表明miR-301b-3p可以促进细胞迁移和侵袭;2.4干扰miR-301b-3p后,免疫印迹实验显示细胞周期相关分子C-myc、CCND1表达下调,EMT相关分子N-Cadherin、Vimentin、Slug表达下调,而E-Cadherin表达上调;细胞信号通路相关蛋白FAK、PI3K、AKT表达无明显变化,p-FAK、p-PI3K、p-AKT表达量下调,提示miR-301b-3p有可能通过FAK/PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。结论miR-301b-3p能促进乳腺癌细胞株MDA-MB-231和SKBR3增殖、迁移和侵袭,具体作用可能通过FAK/PI3K/AKT信号通路来实现。