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植物寄生线虫是植物的重要病害之一,已成为制约农业生产良好发展的重要因素。生物防治线虫具有对环境和人类危害小并且不会产生抗药性的优势,已成为线虫防治的研究热点。然而以天然活菌剂为基础的生物杀线剂毒力小、稳定性差对温度敏感造成实际生防效果缓慢效率低下。因此,研究食线虫微生物侵染线虫的毒力因子及其作用的分子机制对提高生物杀线剂的稳定性和毒力,促进生物杀线剂的实际生防效率具有重要的意义。侧孢短芽孢杆菌G4产生的丝氨酸蛋白酶BLG4是强杀线虫的主要毒力因子,是研究丝氨酸蛋白酶侵染线虫机制的理想材料。本论文通过蛋白质定向进化技术研究丝氨酸蛋白酶降解线虫体壁并杀死线虫的结构基础和分子机理。通过对16S rRNA基因序列的分析,从分子水平上确认出发菌就是具有高效杀线虫毒力的Brevibacillus laterosporus G4菌株;利用单因素试验结合Plackett-Burman设计和响应面法设计优化B.laterosporus G4的发酵培养体系,获得的培养体系摇瓶发酵30小时蛋白酶活力可达12379 U/ml,比优化前提高了5倍。采用单因素设计试验对芽孢杆菌转化体系进行优化,获得的转化系统电转效率可达6.0×10~4 cfu/μgDNA,存活率达到3.0%;分别利用枯草芽孢杆菌整合型表达载体pSG1729B和自主独立复制型表达载体pHY3000PLK构建蛋白酶BLG4的异源重组表达质粒,并成功实现在B.subtilis WB600中的稳定高效和高通量表达。运用易错PCR技术扩增蛋白酶BLG4的成熟肽片段,然后采用重叠延伸PCR技术获得具有完整编码区的突变基因,连接到pMD-T 18 Simple Vector构建库容约为5.1×10~4 cfu、突变率为0.536%的高质量蛋白酶BLG4的随机突变文库。应用B.subtilis WB600表达体系构建蛋白酶BLG4的随机突变表达文库,高通量筛选获得热稳定性得到较大改善的突变体Mut-01。通过对突变体Mut-01的氨基酸序列和模拟的空间结构分析表明,207位的Cys与222位的Met引入形成的二硫键,使得突变体的空间结构更加紧凑稳定是热稳定性提高的主要原因,为提高生物杀线剂的实际生防稳定性提高了理论基础。突变文库的构建及其分析为下一步筛选侵染线虫活性发生改变的突变子,研究侵染酶降解线虫体壁的结构基础和分子机理奠定了基础。