牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种急性、热性、接触性传染病。牛是主要宿主及传染源。IBRV组织嗜性广,可引起包括牛的鼻气管炎、脓性阴道炎、包皮龟头炎、流产、不孕不育症、结膜炎、脑炎等多种临床症状。病毒易于三叉神经节建立潜伏感染,造成病毒的持续存在并大量排毒,使得IBRV感染难以清除。急性IBRV呼吸道感染引起的牛继发性细菌性肺炎,是造成养牛业经济损失的重要原因之一。该病于上世纪50年代在美国首次发现,现呈世界范围分布。血清学调查表明,我国大部分地区存在IBRV感染。g D蛋白是IBRV主要囊膜糖蛋白之一,在病毒的吸附及入侵过程中具有重要作用,能够诱导中和抗体的产生。目前,国内尚无标准化的IBRV检测方法,国外的检测试剂盒价格昂贵,因此,有必要开展相关检测技术方面的研究。本研究利用大肠杆菌表达系统对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的g D蛋白进行了原核表达,免疫印迹试验表明其免疫原性良好。用超离纯化的IBRV免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,重组g D蛋白进行加强免疫,经常规细胞融合,获得了13株单克隆抗体(MAb),其中4株(2D8、3F9、1G3、5B7)可与重组g D蛋白和IBRV全病毒反应,其余9株(2E4、3C2、4E8、1F5、4H5、6B6、3F3、2A9、4D11)仅与IBRV全病毒反应,不与重组g D蛋白反应。单抗1G3具有病毒中和活性,中和效价为1:32。免疫印迹及间接免疫荧光试验表明这13株单抗具有良好的反应性。特异性试验表明这13株单抗只与IBRV反应,不与牛腺病毒3型(BAV-3)及牛副流感病毒3型(BPIV3)反应。应用肽扫描技术对g D蛋白进行GST融合短肽截短表达,对MAb 1G3识别的抗原表位进行了鉴定,结果表明MAb 1G3识别的最小反应活性单元是6肽260ESKGYE265,识别的最大反应活性的最小单元是7肽259EESKGYE265。抗原表位保守性分析表明,该抗原表位在IBRV各分离株中完全保守,而在其他与IBRV相关的反刍动物疱疹病毒如山羊疱疹病毒1型(Cp HV-1)、鹿疱疹病毒1型(Cv HV-1)及驼鹿疱疹病毒1型(Elk HV-1)等差异较大。同时,本研究利用MAb 3C2作为捕获抗体、1F5作为检测抗体建立了可用于检测IBRV抗原的双抗夹心ELISA。特异性实验表明该方法只针对IBRV,不与BAV-3、BPIV3及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等其他引起牛呼吸道疾病的病原反应。通过24份阴性样品的检测,确定该方法的Cut-off值为0.24,当样品OD450值大于0.24时,判定为阳性;等于或低于0.24时判定为阴性。敏感性试验表明,该方法可以检测102.9TCID50/0.1 ml的IBRV,与PCR方法检测临床样品的符合率为90.5%。重复性试验表明该方法具有良好的稳定性。综上所述,本研究制备了13株IBRV单抗,这些单抗与IBRV具有良好的反应性。对针对g D蛋白的一株中和性单抗1G3进行了表位鉴定,结果鉴定出了一个抗原表位。同时,利用单抗3C2和1F5初步建立了检测IBRV抗原的双抗夹心EISA,可试用于IBRV的病原检测。本研究为IBRV的糖蛋白g D的生物学结构和功能及IBRV致病性的深入研究奠定了基础,同时为IBRV的病原学诊断提供了技术支撑。