论文部分内容阅读
嫩度是牛肉最重要的食用品质,影响着消费者的满意度,牛肉的嫩化机制一直是肉类科学研究的热点和难点。过氧化物还原酶6（Peroxidase 6,Prdx6）作为动物体内重要的抗氧化防御酶,可以通过调节细胞内的氧化应激水平,调控宰后成熟过程中牛肉的嫩度。研究表明,Prdx6可以作为牛肉嫩度的生物标志物,但Prdx6在牛肉成熟过程中对嫩度的影响及其调控嫩度的具体机制尚不明确。本实验选取6头宰前管理条件一致的西门塔尔杂交牛的左半胴体背最长肌作为实验样品,将肉样切块后分别浸泡在过氧化氢（H2O2,直接氧化应激处理）、巯基琥珀酸（mercaptosuccinic acid,MA,抑制Prdx6的非硒依赖谷胱甘肽过氧化物酶（non-selenium glutathione peroxidase,NSGPx）活性处理）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC,抑制氧化应激并提高NSGPx活性处理）和生理盐水（对照组）中,孵育0、6、12、24、72、168 h。通过测定Prdx6的表达量、NSGPx活性以及剪切力和细胞骨架蛋白的降解程度,探究在成熟过程中Prdx6与牛肉嫩度之间的关系;测定细胞凋亡率、蛋白质羰基含量等指标,从细胞凋亡和蛋白质氧化角度探究Prdx6对牛肉嫩度的调控机制;并通过蛋白质组学分析,探究调控牛肉嫩度的关键蛋白质及相关通路,以系统阐释牛肉嫩度的形成机制。本研究主要结果如下:（1）在牛肉成熟过程中,H2O2处理显著增加了细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）相对含量（P＜0.05）,MA处理显著增加了热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）的表达量（P＜0.05）,表明两组样品中的氧化应激水平显著升高。在宰后初期（宰后前24 h）,H2O2处理组和MA处理组的Prdx6表达量显著增加（P＜0.05）,除MA处理组外,其他三组的NSGPx活性显著增加（P＜0.05）,表明机体会在宰后初期自适应合成Prdx6并提高其NSGPx活性来抵御氧化应激危害。在宰后成熟第3 d,H2O2处理组的剪切力值显著低于NAC处理组（P＜0.05）,MA处理组的剪切力值显著低于其他三组（P＜0.05）,肌间线蛋白（desmin）在宰后初期的降解程度与剪切力结果相似。研究结果表明,在成熟过程中,直接氧化应激处理和抑制NSGPx活性处理加速了牛肉的嫩化过程,且抑制NSGPx活性处理组的嫩化速度更快,Prdx6的NSGPx活性与嫩度呈负相关关系。（2）Prdx6的NSGPx活性通过细胞凋亡和蛋白质氧化途径调控牛肉的嫩度。H2O2处理组和MA处理组的肌浆内Ca2+浓度、细胞凋亡率、细胞凋亡酶9（Caspase 9）活性和Caspase 3活性显著高于NAC处理组（P＜0.05）,MA处理组的细胞凋亡率和Caspase3活性显著高于H2O2处理组（P＜0.05）,表明直接氧化应激处理和抑制NSGPx活性处理显著提高了牛肉成熟过程中的细胞凋亡程度,且抑制NSGPx活性处理组的细胞凋亡程度更大。同时,直接氧化应激处理和抑制NSGPx活性处理在宰后初期提高了μ-钙蛋白酶活性。H2O2处理组和MA处理组在宰后72～168 h的蛋白质氧化程度显著高于NAC处理组和对照组（P＜0.05）,表明直接氧化应激处理和抑制NSGPx活性处理主要在宰后成熟72 h后造成蛋白质氧化程度显著增加。因此抑制Prdx6的NSGPx活性促进了Caspases级联反应和细胞凋亡,并在宰后初期提高了μ-钙蛋白酶活性,而蛋白质氧化程度的增加会使蛋白质分子构象发生改变,通过细胞凋亡和蛋白质氧化途径加速细胞骨架蛋白的降解,进而提高牛肉的嫩度。（3）通过蛋白质组学研究发现,泛素-蛋白酶体依赖的蛋白质分解相关蛋白质在宰后0 h vs 24 h的总差异蛋白质中占近1/3的比例,在宰后初期影响着牛肉嫩度的形成。除了参与细胞结构组成的蛋白质以外,与嫩度显著相关的差异蛋白质主要参与蛋白质、碳水化合物和脂质的分解代谢,以及细胞凋亡、钙稳态和呼吸电子传递链等过程。其中异丁酰辅酶A脱氢酶（ACAD8）、2-磷酸-D-甘油酸水解酶（ENO2）、酰基辅酶A氧化酶（ACOXL）、碳酸酐酶（CA）等代谢酶,酸性富亮氨酸核磷酸蛋白32家族成员A（ANP32A）等细胞凋亡相关蛋白质,以及NADH-泛醌氧化还原酶（ND）、细胞色素c氧化酶亚基7A1（COX7A1）等呼吸电子传递链相关蛋白质可能是影响牛肉嫩度的潜在因子,值得进一步研究。