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硫化氢(H2S)是一种危险的空气污染物,随着工业化的不断发展,空气中H2S污染引起的危害逐渐引起人们的重视。H2S可对机体的呼吸系统、心血管系统及神经系统等多个系统的组织器官产生毒性效应。细胞凋亡与程序性坏死是外源性毒物诱导细胞死亡的主要形式,这两种细胞死亡模式在呼吸道疾病中起重要作用。MicroRNA(miRNA)作为一种非编码RNA,可以通过靶向调控其目的基因转录后表达介导体内多种生物反应,对于调控细胞执行程序性死亡发挥重要作用。近年来研究发现miRNA在一些环境污染物中毒和疾病中发挥重要调控作用,miRNA逐渐被认可作为一种环境污染物与某些疾病的联系的潜在生物标志物。长链非编码RNA(lncRNA)可在细胞质中与miRNA结合,作为分子海绵调控miRNA发挥功能。目前,lncRNA是否参与H2S诱导的呼吸道损伤,且功能如何还未见报道。因此,本试验以肉鸡为研究对象,通过在环境控制仓中持续通入H2S(0-3周龄4 mg/m3,4-6周龄20 mg/m3)气体来建立体内H2S暴露模型,添加H2S外源性供体NaHS建立体外鸡肝癌细胞(LMH)H2S暴露模型,应用透射电镜、扫描电镜、转录组学检测技术、免疫印迹、实时荧光定量PCR技术、流式细胞术、生物信息学方法等,检测气管组织形态学变化、lncRNA表达谱、细胞凋亡与程序性坏死,以及分析筛选与细胞凋亡和程序性坏死相关信号转导通路、构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络并进行验证,旨在证实H2S暴露引起的气管组织细胞死亡的类型,阐明lncRNA在其中的作用机制。主要研究结果如下:(1)病理组织学观察结果显示,H2S暴露后引起了鸡气管上皮细胞脱落,其中纤毛细胞缺失严重,在病灶处有大量炎性细胞浸润。扫描电镜结果显示气管上皮纤毛缺失、凌乱,大量粘液附着在纤毛表面。透射电镜观察结果显示,H2S暴露组中,细胞膜、细胞核膜连续性破坏;染色质凝聚、边聚;线粒体嵴肿胀、破裂、空泡化;粗面内质网脱颗粒、断裂。表现为典型的细胞坏死和细胞凋亡特征,说明H2S暴露能够引起气管组织炎性损伤、细胞凋亡及坏死的发生。(2)H2S暴露引起鸡气管组织中6个lncRNAs表达上调,10个lncRNAs表达下调(log2fold change>0.585或<-0.585,FDR<0.05)。通过qRT-PCR技术对部分转录本进行验证,证实了转录测序技术的可靠性,表明H2S暴露能够影响鸡气管组织lncRNA的表达。对下调的前五个lncRNAs进行细胞内定位,发现lncRNA3037是定位于细胞质中表达下调最大的lncRNA。(3)通过生物信息学技术,预测lncRNA3037能够与miR-15a靶向结合,并且miR-15a在H2S暴露组鸡气管组织中的表达量显著高于对照组,暗示lncRNA3037可能作为miR-15a的分子海绵。双荧光素酶报告系统检测证实了lncRNA3037能够靶向结合miR-15a。通过lncRNA3037和miR-15a过表达与敲低,证明lncRNA3037与miR-15a表达均可负向调控。另外,敲低lncRNA3037或过表达miR-15a可抑制miR-15a靶基因BCL2与A20的表达,敲低miR-15a能够逆转敲低lncRNA3037对与BCL2与A20的抑制作用。上述结果表明lncRNA3037能够作为miR-15a的分子海绵调控miR-15a靶基因A20与BCL2的表达。(4)H2S暴露诱导气管组织中程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3和p-MLKL表达升高,抗程序性坏死因子A20表达降低,凋亡诱导因子BAX与caspase 3升高,抗凋亡因子BCL2表达下调。体外试验结果显示,H2S暴露后LMH细胞活性以浓度依赖性方式降低,细胞凋亡率与坏死率均增高,程序性坏死和凋亡相关蛋白也呈相应的表达模式。证实了H2S暴露引起鸡气管组织和LMH细胞程序性坏死和凋亡的发生。在建立鸡LMH细胞miR-15a过表达/敲低模型的基础上,用程序性坏死抑制剂(Nec-1)、凋亡抑制剂(z-VAD-fmk)、H2S供体NaHS与lncRNA3037的siRNA处理细胞,结果显示miR-15a过表达细胞的程序性坏死率与凋亡率明显升高,并可分别被Nec-1或z-VAD-fmk抑制。另外,敲低miR-15a能够减少NaHS处理或lncRNA3037敲低诱导的细胞凋亡与程序性坏死率。上述结果表明,lncRNA3037的表达降低,导致其不能竞争性吸附miR-15a,增强了miR-15a对靶基因BCL2与A20的抑制作用,进而引起细胞凋亡和程序性坏死发生。综上所述,H2S暴露能够引起鸡气管组织炎性损伤、细胞凋亡与程序性坏死发生,诱导lncRNA表达谱变化,其中定位于细胞质中的lncRNA3037表达降低,miR-15a表达升高,A20与BCL2表达降低。A20与BCL2为miR-15a的靶基因,lncRNA3037能够靶向结合miR-15a而调控BCL2与A20表达。进一步研究证实,H2S暴露抑制lncRNA3037表达,通过miR-15a下调BCL2与A20的表达引起细胞凋亡与程序性坏死的发生。本研究结果不仅为H2S毒理学研究提供科学依据,同时为H2S暴露相关疾病提供可能的预防和治疗依据手段,为畜禽健康养殖提供环境决策依据。