研究目的:青光眼是一种以高眼压为最主要危险因素、以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的进行性丢失为病理基础的视神经退行性疾病。实验性青光眼动物模型是研究青光眼的发病机制和治疗方法的必要工具,最常用的青光眼动物模型是实验性大鼠或小鼠慢性高眼压模型,但目前常采用的建模方法（如角膜缘处激光光凝小梁网法、巩膜上静脉烧灼或结扎法、前房注入微珠法和巩膜上静脉注射高渗盐水法等）各有优缺点,故而有必要研制出一种稳定、有效和简易的新型慢性高眼压模型,为青光眼的基础研究提供便利。硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）是一种新发现的生物内源性气体信号分子,对中枢神经系统退行性病变的神经细胞具有保护作用,但内源性H₂S与青光眼视神经病变的关系及是否具有保护RGCs的作用目前尚未阐明,因此本研究致力于研制一种新型的大鼠慢性高眼压模型,在此基础上观察实验性青光眼视网膜中内源性H₂S的含量及其合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase,CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase,CSE）和巯基丙酮酸转硫酶（3-mercaptopyruvate sulphurtransferase,3-MST）表达的变化,并进一步应用外源性H₂S供体硫氢化钠（sodium hydrosulfide,NaHS）干预来研究H₂S能否保护实验性青光眼RGCs及其具体的作用机制,这将有利于进一步认识青光眼的发病机制,为发掘保护青光眼RGCs的新药物和治疗策略提供实验基础和理论依据。方法:分离纯化Sprague Dawley（SD）大鼠RGCs,采用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒和脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸鸟苷原位末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling,TUNEL）染色法检测一种新型材料——交联水凝胶（cross-linking hydrogel）与RGCs共培养1、3、7天后的生物毒性;采用SD大鼠前房内注射交联水凝胶的方法建立慢性高眼压模型,并检测10周内的眼压变化;于慢性高眼压后2、4、8周,采用上丘注射细胞膜荧光探针（1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethy-indocarbocyanin perchlorate,DiI）逆行标记RGCs,并对视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的RGCs进行计数,并采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法检测视网膜内丛状层、内核层、外核层的厚度和节细胞层内的细胞密度。于慢性高眼压后2、4、8周,检测大鼠血浆和视网膜中内源性H₂S含量的变化情况;采用免疫荧光组织化学法和Western blot法检测CBS、CSE和3-MST蛋白的表达情况。建立大鼠慢性高眼压模型并给予腹腔注射NaHS持续4周,检测视网膜中H₂S的含量;采用上丘注射DiI逆行标记RGCs,并对视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的RGCs进行计数;分离纯化RGCs后应用TUNEL染色法检测RGCs的凋亡情况;采用免疫荧光组织化学法和Western blot法检测视网膜中内源性凋亡调控相关的Bcl-2、Bax和活化的Caspase 3蛋白的表达情况,胶质细胞异常激活相关的Iba-1和GFAP蛋白的表达情况;采用Western blot法检测视网膜中核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）通路活性相关的IκBα和磷酸化IκBα蛋白的表达情况,氧化应激相关的还原型辅酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotidephosphate,NADPH）氧化酶复合物的膜亚基gp91^phox蛋白的表达情况,细胞自噬相关的Beclin-1和LC3蛋白的表达情况;采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测视网膜中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达情况。建立大鼠慢性高眼压模型并给予腹腔注射NaHS联合玻璃体腔注射细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号通路抑制剂PD98059持续4周,采用上丘注射DiI逆行标记RGCs,并对视网膜半径1/6、3/6、5/6区域的RGCs进行计数;分离纯化RGCs后应用TUNEL染色法检测RGCs的凋亡情况;采用免疫荧光组织化学法和Western blot法检测视网膜中Bcl-2、Bax、活化的Caspase 3、Iba-1和GFAP蛋白的表达情况;采用Western blot法检测视网膜中ERK1/2、磷酸化ERK1/2、IκBα、磷酸化IκBα、gp91^phox、Beclin-1和LC3蛋白的表达情况;采用ELISA法检测视网膜中TNF-α的表达情况。结果:CCK-8法和TUNEL染色法检测结果显示,交联水凝胶对RGCs的存活和凋亡无明显影响;大鼠前房内注射交联水凝胶后可升高眼压至少30%并持续10周以上,且成模率为80%;慢性高眼压2、4、8周后,视网膜不同区域的RGCs密度随高眼压时间的增加而逐渐下降,视网膜内核层厚度、外核层厚度和节细胞层内的细胞密度随高眼压时间的增加而不同程度的下降。慢性高眼压大鼠视网膜中内源性H₂S的含量随高眼压时间的增加而下降,血浆中内源性H₂S的含量则无明显改变;视网膜中CBS、CSE和3-MST蛋白的表达随高眼压时间的增加而不同程度地下降。腹腔注射NaHS可显著提高慢性高眼压大鼠视网膜不同区域的RGCs的密度、降低分离纯化的RGCs中TUNEL染色阳性比例,上调Bcl-2/Bax蛋白表达的相对比值,下调活化的Caspase 3、Iba-1、GFAP、gp91^phox、Beclin-1蛋白的表达和磷酸化IκBα/IκBα、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的相对比值,降低TNF-α的含量。腹腔注射NaHS可显著下调慢性高眼压大鼠视网膜中磷酸化ERK 1/2与总体ERK 1/2蛋白表达的相对比值;单纯玻璃体腔注射PD98059对慢性高眼压大鼠视网膜不同区域的RGCs的密度和分离纯化的RGCs中TUNEL染色阳性比例无明显影响,对活化的Caspase 3、Beclin-1蛋白的表达和Bcl-2/Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的相对比值也无明显影响,但可显著下调Iba-1、GFAP、gp91^phox蛋白的表达和磷酸化IκBα/IκBα蛋白表达的相对比值,并显著降低TNF-α的含量;玻璃体腔注射PD98059联合腹腔注射NaHS对慢性高眼压大鼠视网膜中gp91^phox蛋白表达的下调幅度大于单纯玻璃体腔注射PD98059或单纯腹腔注射NaHS,对其余各项指标的影响与单纯腹腔注射NaHS相比无明显差异。结论:大鼠前房内注射交联水凝胶能建立稳定的慢性高眼压模型,该方法操作简单且成模率高;慢性高眼压可导致大鼠视网膜中硫化氢合成酶CBS、CSE和3-MST蛋白的表达下降,进而导致视网膜中内源性H₂S含量的降低;H₂S对慢性高眼压大鼠的RGCs具有保护作用,其保护机制与抑制细胞内源性凋亡、胶质细胞异常激活、NF-κB通路活性、氧化应激、TNF-α表达和细胞自噬有关;H₂S能下调慢性高眼压大鼠视网膜中细胞ERK 1/2信号通路的活性;H₂S对慢性高眼压大鼠视网膜中胶质细胞的异常激活、NF-κB通路活性、氧化应激和TNF-α表达的抑制作用可能与其下调ERK1/2信号通路的活性有关,对细胞内源性凋亡和自噬的抑制作用可能与ERK1/2信号通路无直接关系。