论文部分内容阅读
前言腹膜透析(PD)是治疗终末期肾脏病(ESRD)患者有效的替代方法之一。腹膜长期与非生理的高糖透析液接触及炎症反应的发生等多种因素,发生腹膜纤维化,成为患者退出腹膜透析的主要原因。经上皮-间充质细胞转分化(EMT)而形成的肌成纤维细胞是参与腹膜纤维化的最主要细胞。EMT的特征是上皮细胞标志的丢失以及胞外基质的积聚,主要包括:上皮细胞粘连连接的丧失,例如钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调,重组细胞骨架,瓦解基底膜,以及细胞迁移增强、侵袭能力增强等。小分子RNA(microRNA,简称miRNA),是存在于动植物基因组中,功能性、非编码、小分子RNA,有保守性、基因集簇现象及特异性表达等特点。miRNA在细胞的生命活动中起着非常重要的作用,并且几乎涉及所有生物学进程。既往研究表明,miRNA可参与调节多种组织细胞的EMT过程,包括心脏、肝脏、肺、肾等。最新的研究表明:miRNA29c,miRNA193a等可介导高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。miR-221与肿瘤和纤维化疾病显著相关,miR-221属于miR-221/222基因家族,miR-221可促进乳腺癌的发生,并且在甲状腺乳头状癌、前列腺癌中表达明显升高。研究表明:其家族成员可能通过调节肿瘤细胞及其他组织细胞的EMT过程,参与肿瘤的转移与侵袭,以及组织器官的纤维化,并且可以通过调控表达,进而有效地降低或逆转EMT和纤维化程度。探讨miR-221对高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT的影响及机制,为减轻EMT及腹膜纤维化提供新的思路。材料与方法1、实验动物:清洁级SD雄性大鼠,体重180-220克,8周龄。2、人腹膜间皮细胞株HMr SV5。3、腹腔注射4.25%标准腹透液,建立腹膜透析组大鼠模型,周期28天。处死大鼠,取大鼠脏层腹膜,提取组织蛋白和mRNA,用Western Blot、Real Time PCR法检测E-cadherin、vimentin,PIK3R1,及miR-221表达。4、Targetscan软件预测miR-221的靶基因。荧光素酶报告基因明确miR-221的靶基因。5、High glucose(2.5%)刺激HMrSV5 24h、48h后,用Western-blot、Realtime PCR法检测E-cadherin、vimentin,PIK3R1,及miR-221表达。6、HMrSV5细胞中转染miR-221 inhibitor及对照,利用高糖处理后,检测Ecadherin、vimentin,PIK3R1表达。Trsnswell分析细胞迁移能力。7、HMrSV5细胞中转染PIK3R1及对照,利用高糖处理后,检测E-cadherin,Vimentin。Trsnswell分析细胞迁移能力。实验结果1、大鼠模型组28天后,大鼠腹膜E-cadherin表达减少、vimentin表达增多,PIK3R1表达减少,miR-221表达增多。2、High glucose(2.5%)刺激HMrSV5 24h、48h后,HMrSV5细胞中Ecadherin表达减少、vimentin表达增多,PIK3R1表达减少,miR-221表达增多。3、Targetscan软件分析PIK3R1基因3’UTR区存在miR-221结合位点,进一步荧光素酶报告基因分析明确PIK3R1基因3’UTR区522-528为miR-221结合位点。4、HMrSV5细胞中转染miR-221 inhibitor及对照,利用高糖处理后,转染miR-221 inhibitor的HMrSV5细胞较对照组细胞E-cadherin和PIK3R1表达增多,vimentin表达减少。细胞迁移能力降低。5、HMrSV5细胞中转染PIK3R1及对照,利用高糖处理后,转染PIK3R1的HMrSV5细胞PIK3R1和E-cadherin表达增多,Vimentin表达减少。细胞迁移能力降低。结论1、大鼠腹膜及HMrSV5细胞发生EMT变化过程中,miR-221表达增多,与EMT正相关。2、PIK3R1是miR-221的主要靶基因之一。3、大鼠腹膜及HMrSV5细胞发生EMT变化过程中,PIK3R1表达减少,与EMT负相关。4、下调miR-221表达,可抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT,使PIK3R1表达增多,细胞迁移能力降低。5、PIK3R1过表达,可抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT,细胞迁移能力降低。综上所述:miR-221可能通过调节PIK3R1参与腹膜间皮细胞EMT。