大团囊虫草菌转录因子BlnR对balanol生物合成的调控及其发酵工艺优化

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真菌次级代谢产物十分丰富,是天然药物的重要来源。我们的研究对象是本实验室自主分离获得的大团囊虫草菌(Tolypocladium ophioglossoides L2)。课题组在前期工作中对菌株进行了全基因组测序,经生物信息学分析,通过高表达bln簇内调控基因bln R,成功激活了该隐性基因簇并成功分离鉴定到balanol和其他新产物。Balanol是非选择性靶向蛋白激酶C(PKC)和c AMP依赖性蛋白激酶(PKA)的ATP抑制剂,而PKA和PKC通常与肿瘤发生有关,并且是抗癌药物的潜在靶点。BlnR是bln基因簇内唯一的调控蛋白,生物信息学比对分析得出BlnR属于Zn2Cys6家族调控因子。为探究BlnR蛋白对bln基因簇的调控功能,我们研究BlnR蛋白与簇内各基因启动子区域的结合情况。本论文对BlnR的DNA结合结构域(DBD)进行异源表达和纯化,EMSA实验结果显示BlnRDBD蛋白除了能够特异性结合于自身基因的启动子区域外,还能特异性结合于簇内其他基因启动子区域,表明BlnR通过调控bln基因簇的所有基因来调控balanol的合成。由于BlnR通过直接激活bln基因簇生物合成基因的转录而调节balanol的产生,因而调控机制的阐明,可以为后续继续提高balanol的发酵单位提供指导依据。Balanol的化学全合成较为复杂,且对环境友好性不佳,而其在真菌中的天然产量极低。因此,本论文进而研究了大团囊虫草菌T.ophioglossoides bln ROE生产balanol的发酵工艺,为balanol的规模化生产提供理论基础和支持。首先在摇瓶水平通过PB实验得到显著性影响因子,其次通过响应面分析法优化了培养基成分和培养条件,确定了最终发酵培养基配方:蔗糖100 g/L,多聚蛋白胨13.6 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸二氢钾0.6 g/L,硫酸镁1.0 g/L,初始p H 4.9,接种量2%。培养基成分与培养条件的优化使得balanol的发酵单位由700 mg/L增加到2177.11 mg/L。并在15L发酵罐进行了验证,发酵单位为2187.39 mg/L,为balanol的规模化高产打下基础。
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