淇河鲫(Qihe crucian carp Carassius auratus),具有很高的营养和经济价值。近年来,高密度、集约化的养殖模式,导致鱼类疾病暴发。因此,提高免疫能力对控制鱼类疾病的发生显得尤为重要。溶菌酶(Lysozyme,Lys)是一种重要的非特异性免疫因子,它通过水解细菌细胞壁的β-1,4糖苷键而杀死细菌,对鱼类抵御外界细菌入侵具有重要作用。本研究以河南鹤壁水产养殖场的淇河鲫为研究对象,以肝脏总RNA为模板,使用RT-PCR和RACE技术克隆淇河鲫c型和g型溶菌酶c DNA全长;采用荧光定量PCR法和比浊法对淇河鲫不同组织溶菌酶的表达及酶活性进行测定;同时对经嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理后,各组织溶菌酶表达变化及酶活性进行分析,为研究淇河鲫溶菌酶的免疫防御功能及分子机制奠定理论基础。基因克隆获得c型溶菌酶c DNA全长为679 bp,开放阅读框为438 bp,编码145个氨基酸。理论等电点为8.86,相对分子质量为1.66 ku。含有两个保守的氨基酸催化位点,分别是Glu(第53位)和Asp(第69位)。八个保守的Cys,可形成四对二硫键。含有N端信号肽,为一种分泌蛋白。g型溶菌酶c DNA全长806 bp,开放阅读框为564 bp,编码187个氨基酸。理论等电点为9.04,相对分子质量为2.09 ku。三个保守的催化位点分别是Glu(第73位)、Asp(第86位)和Asp(第97位),有一个Cys残基,不形成二硫键,无N端信号肽,为胞内蛋白。同源性分析显示,淇河鲫c型溶菌酶与金鱼同源性最高,为99.3%,与其它鲤形目鱼类同源性在80%以上,但与硬骨鱼类的同源性较低,仅为40%左右。淇河鲫g型溶菌酶与鲤形目鱼类同源性为70%~80%,与其它硬骨鱼类同源性在50%~70%。系统进化树表明,c型和g型溶菌酶分别聚为两大类。c型溶菌酶中鱼类分为两个分支,鲤形目鱼类为一支,其它鱼类为一支,这与同源性分析结果一致,说明鲤形目鱼类c型溶菌酶在进化上较为独立。对于g型溶菌酶而言,进化树中鱼类聚为一大类。淇河鲫不同组织溶菌酶基因表达量的检测结果显示,c型和g型溶菌酶均有表达,但二者在不同组织中基因表达量不同。c型溶菌酶在肾脏和头肾中表达量较高,分别是肝脏的188.6倍和316.7倍,但是g型溶菌酶在各组织的表达量无较大差异。淇河鲫不同组织溶菌酶活性检测显示,各组织均有溶菌酶活性,体表粘液中溶菌酶活性最高,且与其它组织呈极显著性差异(P<0.01)。淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞菌和LPS后,对两种溶菌酶基因在不同组织的表达测定发现,c型和g型溶菌酶在肝脏中表达量增加明显,且与对照组呈极显著性差异(P<0.01);在鳃中两种溶菌酶表达量呈先升高后降低。脾脏中c型溶菌酶基因表达量升高,g型溶菌酶无明显变化。但在肾脏和头肾中g型溶菌酶表达量升高,c型溶菌酶变化甚微。对刺激后不同组织溶菌酶活性进行测定,结果显示溶菌酶活性与基因表达变化相似,均呈先上升后下降趋势。这种受刺激后c型和g型溶菌酶在不同组织中的表达及酶活性的上调,说明二者对病原菌或类似物均有m RNA水平上及酶活性的表达响应,在抵御细菌入侵上可能扮演重要角色。结论:1.克隆出淇河鲫c型和g型溶菌酶c DNA全长:c型溶菌酶c DNA全长679 bp,编码145个氨基酸;g型溶菌酶c DNA全长806 bp,编码187个氨基酸;它们具有酶的典型结构特征。2.淇河鲫c型和g型溶菌酶在机体不同组织具有广泛的表达,c型溶菌酶肾脏和头肾中高表达,g型溶菌酶表达量无较大差异;淇河鲫溶菌酶在不同组织中均有活性,在体表粘液中活性最高。3.淇河鲫注射嗜水气单胞菌和LPS后,不同组织c型和g型溶菌酶表达量及酶活性均上调,说明二者对病原菌及类似物有免疫响应,在抵御细菌入侵时发挥一定作用。