目的:大肠癌是世界性的恶性肿瘤，发病率已占到常见肿瘤的第三位，是严重危害生命健康的疾病。早期大肠癌治疗以手术为主，结合术后化疗，但这些治疗仍然难以避免患者面临的肿瘤复发风险。因此寻找大肠癌的肿瘤标志物与特异抗原或相关抗原，早期发现大肠癌，使患者早期接受手术治疗，提高5年生存率就显得十分重要。癌胚抗原(CEA)是大肠癌临床诊断的指标之一，但特异性不高。　　近年来，分子标志物在肿瘤治疗中的作用日益受到关注，一些在肿瘤组织特异性表达或高表达的肿瘤抗原是肿瘤标志物的主要组成部分。研究肿瘤抗原的分子机制，可以为临床上肿瘤免疫诊断和治疗提供理论基础。　　抗体为基础的免疫治疗一直是极有前景的肿瘤治疗方法，许多单克隆抗体药物已经被批准应用到临床治疗并有效提高临床患者的生存率。本研究室成功制备鼠抗人大肠癌单克隆抗体ND-1，可识别人类大分子量结肠癌细胞表面抗原LEA。间接免疫荧光实验结果表明，百分之九十的大肠癌细胞系表达抗原LEA，而46株非大肠癌细胞系不表达抗原LEA，人类肿瘤冰冻切片组织和正常胎儿组织也表达抗原LEA，近千例临床病理显示，抗原LEA在正常组织、非大肠癌组织和良性病变中几乎不表达或表达量很低，而对中高分化的大肠癌是较特异的肿瘤相关抗原。间接免疫荧光实验证实LEA的表达不同于CEA，在大肠癌诊断特异度方面，抗原LEA强于CEA。因此，本文的研究集中鉴定单克隆抗体ND-1的特异性抗原LEA，进而探讨此蛋白在肿瘤发生中的作用。　　90年代第一次建立了重组cDNA表达文库的筛选方法，开创了检测肿瘤抗原的新时代，通过筛选文库已克隆出上千种目的基因。为了提高筛选的特异性，在此基础上，单克隆抗体因其对相应靶抗原具有高度的特异性而成为抗肿瘤药物研发和肿瘤靶向治疗的主要领域，运用特异性抗体筛选文库将更有利于找到靶抗原。因此，本研究构建了人大肠癌细胞系CCL-187 cDNA表达文库，用单克隆抗体ND-1筛选文库得到与肿瘤生物行为相关的抗原基因。　　同时，大规模蛋白质组学已成功用于差异蛋白的表达分析。因此，本文采用质谱分析的方法，通过免疫沉淀分离出单克隆抗体ND-1特异结合的抗原LEA，通过质谱鉴定及一系列细胞生物学和生化方法验证，最后推测抗原LEA为血影蛋白βⅡ(Beta-Ⅱ spectrin，β2SP)。尤为重要的是，免疫显微镜观察到β2SP特异性的细胞膜定位;用Beta-Ⅱ spectrin siRNA干扰后，细胞膜表面抗原LEA的表达显著抑制。此外，我们对Beta-Ⅱ spectrin表达进一步研究，结果表明:β2SP在大肠癌组织表达和分布与LEA一致。因此，我们认为抗体筛选联合质谱鉴定用于寻找细胞表达蛋白的方法是有效的。　　综上所述，本文通过一系列研究从抗原LEA鉴定、功能验证等方面，推断抗原LEA可能为血影蛋白βⅡ，在大肠癌细胞膜表面的表达与肿瘤分化和转移相关。抗原LEA作为新的大肠癌膜表面标志，有可能成为肿瘤诊断和治疗的新靶标。　　方法:人大肠癌细胞系CCL-187λZAP cDNA表达文库构建及筛选:1、从人大肠癌细胞系CCL-187中提取出总RNA，并纯化出mRNA，将mRNA反转录合成双链cDNA。2、双链cDNA经酶切、分离、除去小片段。3、大于400bp的双链cDNA连接载体，构建表达文库。4、采用蓝白筛选和PCR方法来鉴定cDNA文库并扩增。5、单克隆抗体ND-1筛选文库，获得阳性克隆。6.、阳性克隆复筛，体内剪切，测序及BLAST同源性分析。鉴定和分析单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA∶1、Western Blot检测单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA在大肠癌细胞系CCL-187中的表达情况。　　2、免疫沉淀结合质谱分析来鉴定单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA。3、相互免疫沉淀和免疫印迹实验验证质谱结果。4、抗原LEA与β2SP在细胞表面的特异性定位分析。5、生物素化标记纯化膜蛋白，Western Blot检测蛋白定位细胞膜。6、单克隆抗体ND-1与β2SP抗体竞争结合实验。7、siRNA实验验证质谱结果。8、免疫组织化学方法检测LEA及β2SP在癌变组织中的表达情况。9、鉴定靶蛋白在肿瘤细胞系的表达。　　结果:成功构建了人大肠癌细胞CCL-187的cDNA表达文库:1、构建了人大肠癌CCL-187细胞株cDNA表达文库，原始库容量为2.3×106 pfu/ml，重组率97％。表达文库中的cDNA片段平均大小1 kb以上。可以用其它的抗体或寡核昔酸探针筛选大肠癌的肿瘤相关基因。2、以单克隆抗体ND-1筛选该文库，获得2个阳性克隆。基因序列分别与Homo sapiens KIAA0141(KIAA0141)，transcript variant2、mRNA和Homo sapiens enolase1，(alpha)(ENO1)，mRNA蛋白基因序列同源。鉴定单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA为骨架蛋白:1、首先通过Western blot方法在260kD附近检测到单克隆抗体ND-1特异结合抗原LEA，并使用免疫沉淀及一维电泳分离的方法获得了单克隆抗体ND-1靶抗原，经MALDI-TOF质谱鉴定为蛋白Beta-Ⅱ spectrin。2、用商品化抗β2SP抗体与单克隆抗体ND-1做平行实验，验证ND-1结合的抗原LEA条带与β2SP蛋白在同一位置;相互免疫沉淀及免疫印迹实验得到抗β2SP抗体能够与单克隆抗体ND-1沉淀的抗原杂交，同时，单克隆抗体ND-1也可以与β2SP免疫沉淀蛋白杂交;免疫荧光实验观察到抗原LEA特异性定位于细胞膜表面;抗体竞争实验结果表明抗β2SP抗体和单克隆抗体ND-1竞争和细胞表面靶抗原结合;利用siRNA方法抑制β2SP表达，可以降低抗原LEA的表达;组织化学方法证实抗原LEA和β2SP在大肠癌的表达一致的。　　结论:1、构建了人大肠癌CCL-187细胞株λZAP cDNA表达文库，进一步筛选出与肿瘤生物行为相关的基因。2、初步推测单克隆抗体ND-1特异性结合抗原LEA可能为骨架蛋白β2SP，β2SP在大肠癌组织的表达与LEA表达一致。