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实验背景:肝癌是一种发病率和死亡率持续增高的少数恶性肿瘤之一。肝癌患者在早期没有症状或症状不明显,当发现与诊断时,多已处于晚期阶段,可采取的治疗办法极其有限。索拉非尼(Sorafenib,Sor)是目前唯一被批准用于治疗晚期肝癌的药物。它能提升生存率,又使患者的耐受性好。但易产生敏感性下降及其耐药的问题,是其治疗失败的主要原因。所以,明确肝癌细胞对索拉非尼产生敏感性下降的机制,并寻找解决的办法非常有必要。乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistant protein,BCRP)是一类外排转运蛋白,存在于人类的多种正常组织和癌组织中,可利用ATP水解提供的能量将药物排出胞外,导致细胞产生抗药性。已有研究证明,索拉非尼是BCRP的转运底物。因此,BCRP对索拉非尼的外排作用,很可能是导致肝癌细胞对索拉非尼产生敏感性下降的关键因素。此外,有报道姜黄素(Curcumin,Cur)可作为体内BCRP的选择性抑制剂。那么,姜黄素联用,是否可以解决索拉非尼敏感性下降的问题呢?实验目的:1、以BCRP为切入点,探索肝癌细胞对索拉非尼产生敏感性下降的机制。2、寻找可提高肝癌细胞对索拉非尼敏感性的办法,并阐明分子机制。实验方法:1、本实验采用MTT法检测索拉非尼和姜黄素对人肝癌细胞(Hep G2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-368、SNU-739)增殖的影响,并利用Compu Syn软件测算及分析两者联用的效果及最佳的联用比例。2、使用流式细胞仪和Western blot实验分别检测索拉非尼、姜黄素以及两者联用对细胞凋亡的影响及相关凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、PARP、Caspase-3)表达水平的影响。3、采用瞬时转染法,构建BCRP敲低和高表达的Hep G2及Huh-7细胞模型,基于本模型,再采用MTT实验及Western blot实验检测肝癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。4、采用Western blot实验、高内涵细胞成像实验、高效液相色谱法、生物素标记法、免疫荧光实验解析姜黄素增强肝癌细胞对索拉非尼敏感性的机制。5、建立皮下荷瘤的BALB/c小鼠肝癌模型,在动物水平评价索拉非尼和姜黄素联合抗肿瘤的效果;通过Western blot实验及免疫组化实验,检测小鼠肿瘤灶中BCRP、p-AKT及相关凋亡蛋白(Bcl-2、Cleaved Caspase-3)的表达。实验结果:1、MTT实验结果表明索拉非尼和姜黄素均对肝癌细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量依赖性;当索拉非尼与姜黄素联合作用时,抗肿瘤作用增强,具体表现为细胞活力明显减弱、IC50值降低。Compu Syn软件分析MTT数据,结果显示索拉非尼和姜黄素联用在浓度比为1:1或1:2时,CI值<1,即产生协同的抗肿瘤作用。2、流式细胞仪检测细胞凋亡率以及Western blot实验检测凋亡蛋白的表达量,其结果都显示,索拉非尼与姜黄素联合作用比单加索拉非尼时的细胞凋亡更显著,同样说明了索拉非尼与姜黄素联合作用时产生协同抗肿瘤作用。3、BCRP敲低的肝癌细胞对索拉非尼的敏感性增强;BCRP过表达的肝癌细胞对索拉非尼的敏感性减弱,而联用姜黄素之后敏感性又有所增强,说明BCRP在肝癌细胞对索拉非尼的敏感性中起关键作用,且姜黄素可通过调控BCRP增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。4、Western blot实验检测的结果显示,姜黄素可抑制肝癌细胞中BCRP的蛋白表达;通过进一步地探索发现,姜黄素是通过抑制PI3K/AKT通路进而调控BCRP的表达。5、高内涵细胞成像实验、高效液相分析实验(HPLC)、生物素标记膜蛋白实验、免疫荧光标记实验的结果发现,姜黄素还可通过PI3K/AKT通路抑制BCRP的外排功能。6、动物实验的结果表明,当索拉非尼与姜黄素联用时能更明显地抑制BALB/c小鼠肿瘤的生长;Western blot实验及免疫组化实验检测小鼠瘤组织的结果显示,当索拉非尼与姜黄素联用时p-AKT、BCRP有明显下调,且凋亡蛋白Bcl-2下调、Cleaved Caspase-3上调,这些都与细胞实验的结果相一致。实验结论:姜黄素通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活,抑制BCRP的蛋白表达及功能,增加索拉非尼的胞内蓄积量,进而增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。