组织干细胞对于哺乳动物机体稳态的维持具有重要意义,然而肝脏作为体内最重要的消化器官之一,成体肝脏干细胞怎样参与肝脏细胞的更替与修复却是领域内未解决的基本问题,甚至“肝干细胞是否存在”也一直备受争议。研究成体肝干细胞的主要困难有：首先成熟肝细胞本身具有极强的复制能力,在肝脏遭受机械性损伤或者切除时,肝细胞可自我复制,完成肝脏修复；并且这种修复并不只是局限于一次损伤,有研究证明经历了连续十二次肝切手术的大鼠,其肝脏仍可恢复至原来程度。其次,肝脏和肌肉组织、神经组织类似属于高度慢性更替组织,在正常生理状态下小鼠肝细胞寿命可维持300天左右,因此研究肝干细胞对肝脏的贡献有着较长的时间跨度；而且随着这300天的进程,小鼠已步入衰老状态,肝干细胞是否也会随着机体而衰老导致不参与细胞更替,都是未知的。第三,现有的标志物并不能严格的区分胆管上皮细胞和肝干细胞,而只是笼统的包括在内,给追踪肝干细胞命运造成很大难度和一定程度的偏向性；甚至有人认为Lgr5、CD133等肝干细胞标志物会不同程度的丢失,导致目的细胞“失联”。第四,不同实验室研究肝干细胞时所采用的模型均不一致,有急性损伤比如三分之二肝切手术、四氯化碳注射、胆管结扎,也有慢性药物损伤包括DDC (3,5- diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二乙酯)饲料、CDE饮食(choline-deficient diet supplemented with ethionine,胆碱缺乏、甲硫氨酸补充饲料)、肝纤维化等等；这些模型之间的差异直接导致了所观察的目的细胞在响应不同损伤时的差别,无疑增加了研究肝干细胞的复杂程度。第五,在人类的许多肝脏疾病中,均可观察到被称为“胆管反应”的现象,也就是肝脏实质有许多“胆管细胞样”细胞的出现,这些细胞究竟是什么、起何作用仍是未知的。总结这些因素来看,缺少特异的肝干细胞标志物、不同损伤模型之间的差异、肝实质损伤程度、肝干细胞和人类肝病的关系是肝干细胞研究领域的核心。本课题围绕“肝干细胞是什么”这一领域内基本问题开展研究,试图揭开这一神秘面具并未将来肝干细胞的临床应用提供线索和奠定基础。针对目前肝干细胞研究领域的不足,本研究采用了对肝脏中各类细胞的单细胞深度测序方法,来解决这一问题。首先,利用Cre/LoxP示踪小鼠体系来示踪细胞的命运。基于之前的报道,肝干细胞的共性是表达角蛋白19(Krtl9),因此我们使用了八周龄的Krt 19CreERT/Rosa26R-GFP示踪小鼠进行腹腔注射4毫克他莫昔芬(tamoxifen),来观察表达或者曾经表达Krt19细胞的命运。诱导两天后检测小鼠绿色荧光蛋白(GFP)表达情况或者开始进行损伤；对他莫昔芬诱导后两天的小鼠进行急性损伤(腹腔注射1微升／克体重的四氯化碳)和慢性肝损(含有1%DDC (w/w)的饲料饲喂3周)处理。第二是Krt19谱系细胞的分选、单细胞建库、深度测序和转录组分析。使用流式细胞分选(FACS)方法,将示踪小鼠肝脏的GFP阳性细胞分选后,挑选单个细胞,构建每个细胞单独的cDNA文库(cDNA libraries);利用已知标志物对每个单细胞进行聚合酶链式反应(PCR, Polymerase Chain Reaction)鉴定,初步判断细胞的身份；对候选细胞进行深度测序;测序数据经映射至小鼠转录组(mm9)后进行无监督的层级聚类分析(unsupervised hierarchical clustering analysis)、加权基因共表达网络分析(WGCNA)和差异表达基因分析(differential expression analysis)。第三,针对单细胞转录组分析结果,将候选细胞分类,绘制肝干细胞分化图谱,筛选得到候选肝干细胞表面标志物及其活化相关因子。最后,对筛到的候选相关标志物和活化因子进行实验验证。该研究得到的主要结果包括：1)通过观察Krtl 9CreERT/Rosa26R-GFP示踪小鼠肝脏中GFP阳性细胞的命运,我们发现Krt19谱系细胞可以标记肝脏内的胆管细胞、肝细胞和潜在的干细胞。2)我们将小鼠中Krt19谱系细胞通过流式细胞分选仪分选下来,进行单细胞挑选,共计得到了1094个单细胞；我们构建了每个单细胞的cDNA文库,利用已报道的相关标志物进行经鉴定后,选取了39个候选细胞(包括潜在的干细胞、肝向分化细胞和胆管细胞)并进行单细胞深度测序和转录组分析。3)根据39个细胞的转录组特征可以将得到的细胞分为六群,分别是：静息、活化的两类肝干细胞,肝前体细胞,不成熟肝细胞,成熟肝细胞,胆管细胞。4)根据各群细胞的转录组特点,重构了肝干细胞分化图谱、描绘了各群细胞的分子标签、筛选得到了肝干细胞的特异表面标志物CD63、CD56以及激活静息肝干细胞的关键通路：VEGF和MAPK.5)通过原位染色、体外培养、细胞移植和体内示踪实验,我们证明了CD63是全新的肝干细胞表面标志物。6)CD56可以区分肝脏中静息和活化的肝干细胞：CD63+CD56+是活化的肝干细胞,CD63+CD56是静息的肝干细胞。7)生长因子VEGF和bFGF,作为VEGF和MAPK两条通路的关键调控因子,可以激活静息的肝干细胞。总的来说,通过小鼠肝脏的单细胞转录组分析,我们描绘了小鼠肝干细胞的分化谱系,得到了小鼠肝脏中每类细胞中特异表达的标志基因,证明了CD63是肝干细胞表面标志物以及CD56是活化的肝干细胞标志物；另外bFGF和VEGF可以激活静息(CD63+CD56")的肝干细胞。该研究为成体组织干细胞的研究提供了新的思路和方法,补充了成体组织干细胞中关于肝脏干细胞的内容,开拓了肝干细胞新的研究方向,同时为人的肝干细胞研究奠定了基础。