目的:目前急性心肌梗死的主要治疗手段是及时的再血管化,以恢复血流。尽管再血管化治疗有效的降低了死亡率,但再灌注的血流经过缺血的区域会导致第二次的损伤,也就是所说的缺血/再灌注损伤^[1-5]。线粒体通透性转换孔位于线粒体的内膜,在细胞的凋亡过程中起着重要的作用。在缺血后,再灌注会导致活性氧形成和Ca2+内流等病理生理变化,这些病理生理变化均可促使线粒体通透性转换孔的开放^[6]。MPTP的开放就意味着线粒体通透性转换和线粒体内膜电位的降低,这是线粒体凋亡途径的关键事件^[7-11]。自仙茅中提取的仙茅苷是一种酚苷,具有多种生物活性,例如抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用^[12-15]。因此,在本研究中,我们的目的是通过体内和体外实验,来测试仙茅苷是否减轻心脏缺血/再灌注损伤,并进一步探讨其潜在的机制是否通过抑制MPTP的开放发挥作用。研究方法:1、培养的H9c2细胞每2-3天更换一次培养基,当细胞融合水平达到80-90%时,将细胞置于实验程序（接受实验处理）中,分别以5、10和15μmol/L的仙茅苷或相同体积的1‰二甲基亚砜预处理8小时,除对照组外,其余各组的培养基均用无糖和无FBS的培养基代替,然后在37℃温度下90%N2、5%CO2、5%O2（V/V/V）的三气室中孵育12小时,以诱导缺氧损伤。缺氧处置后,用正常培养基替换厄尔培养基,然后将细胞置于培养箱中,在37℃下用5%的CO2进行1小时的复氧。确定合适的仙茅苷浓度后,再加入苍术苷组重复上述的缺氧/复氧操作,以探索仙茅苷保护作用的机制。2、雄性Wistar大鼠均在标准实验条件下饲养,当大鼠适应生活环境后接受实验处理。分别以5mg/kg、10mg/kg和15 mg/kg的仙茅苷或者相同体积的1‰二甲基亚砜腹腔注射,连续7天。7天后离体大鼠心脏,应用Langendoff灌流系统对离体心脏缺血30min、再灌注60min,制备出缺血/再灌注模型。确定仙茅苷合适药量后,再加入苍术苷组重复上述的缺血/再灌注操作,以探索仙茅苷保护作用的机制。3、应用CCK8测定H9c2心肌细胞的活力。4、测定LDH判定H9c2心肌细胞的损伤程度。5、应用台盼蓝染色测定H9c2心肌细胞的生存率。6、应用流式细胞术测定H9c2心肌细胞的凋亡率。7、应用罗丹明123染色法评估H9c2心肌细胞线粒体膜电位的变化情况。8、应用Real time PCR测定H9c2心肌细胞中MPTP下游凋亡通路相关因子的mRNA表达情况。9、应用Western blot测定H9c2心肌细胞中MPTP下游凋亡通路相关因子的蛋白表达情况。10、应用钙诱导法评估H9c2心肌细胞MPTP的开放程度,计算min/max A540。11、应用Real time PCR测定H9c2心肌细胞中调控MPTP开放相关因子的mRNA表达情况。12、应用Western blot测定H9c2心肌细胞中调控MPTP开放相关因子的蛋白表达情况。13、应用Langendoff灌流系统,通过记录心率和冠脉流量,评估Wistar大鼠心功能。14、应用HE染色评估Wistar大鼠心肌显微结构的改变。15、应用TTC染色评估Wistar大鼠心肌梗死的面积。16、应用TUNEL染色法测定Wistar大鼠心肌的凋亡率。17、应用Real time PCR测定Wistar大鼠心肌中MPTP下游凋亡通路相关因子的mRNA表达情况。18、应用Western blot测定Wistar大鼠心肌中MPTP下游凋亡通路相关因子的蛋白表达情况。19、应用Real time PCR测定Wistar大鼠心肌中调控MPTP开放相关因子的mRNA表达情况。20、应用Western blot测定Wistar大鼠心肌中调控MPTP开放相关因子的蛋白表达情况。21、对实验结果进行统计分析,所有的研究结果以均数±标准差表示。3组或者3组以上的多样本间比较使用单因素方差分析,采用最小显著性差异检验进行两两间多重比较分析。如果P<0.05,被认为有显著的统计学意义的差异。结果:1、仙茅苷组H9c2心肌细胞的活力较缺氧/复氧组和溶剂组显著改善,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时活力进一步显著改善。仙茅苷组H9c2心肌细胞的LDH活性较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时LDH活性进一步显著降低。仙茅苷组H9c2心肌细胞的存活率较缺氧/复氧组和溶剂组显著改善,其中较5μM比较,仙茅苷浓度在10μM和15μM时存活率进一步显著改善。通过实验结果证明,上述三个药物浓度的仙茅苷对H9c2心肌细胞均有不同程度的保护作用,而且10μM和15μM保护效果相当,且均较5μM的保护保护作用更强,所以选择了10μM浓度作为下一步的机制研究所应用。2、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中冠脉流量和心率较缺血/再灌注组和溶剂组显著升高,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时冠脉流量和心率进一步显著升高。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中梗死面积较缺血/再灌注组和溶剂组显著减小,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时梗死面积进一步显著减小。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中水肿和炎性细胞侵润等病理变化较缺血/再灌注组和溶剂组显著减少,其中较5mg/kg比较,仙茅苷药量在10mg/kg和15mg/kg时水肿和炎性细胞侵润等病理变化进一步显著减少。通过实验结果证明,上述三个药物剂量的仙茅苷对Wistar大鼠心肌均有不同程度的保护作用,而且10 mg/kg和15 mg/kg保护效果相当,且均较5 mg/kg的保护保护作用更强,所以选择了10 mg/kg的药物剂量作为下一步的机制研究所应用。3、仙茅苷组H9c2心肌细胞的凋亡率较缺氧/复氧组和溶剂组显著改善,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。仙茅苷组H9c2心肌细胞膜电位降低较缺氧/复氧组和溶剂组显著改善,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。4、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,cytochrome C、APAF-1、caspase 9和caspase3的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,cytochrome C、APAF-1、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显著降低,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。5、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,MPTP开放的敏感性较缺氧复氧组和溶剂组显著降低,min/max A540显著高于缺氧复氧组和溶剂组,但应用苍术苷干预后可以显著逆转上述改变。6、在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,Bax的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,Bcl-2的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著升高,Bcl-2/Bax的mRNA水平比值较缺氧/复氧组和溶剂组显著升高,但应用苍术苷干预后可以显著逆转上述改变。在仙茅苷组H9c2心肌细胞中,Bax的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著升高,Bcl-2/Bax的蛋白水平比值较缺氧/复氧组和溶剂组显著升高,但应用苍术苷干预后可以显著逆转上述改变。7、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌凋亡率较缺血/再灌注组和溶剂组显著改善,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。8、在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中,cytochrome C、APAF-1、caspase 9和caspase 3的mRNA表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显著降低,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。在仙茅苷组中Wistar大鼠心肌中,cytochrome C、APAF-1、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显著降低,但应用苍术苷干预后可以显著逆转这种改变。9、在仙茅苷组Wistar大鼠心肌中,Bax的mRNA表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,Bcl-2的mRNA表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显著升高,Bcl-2/Bax的mRNA水平比值较缺血/再灌注组和溶剂组显著升高,但应用苍术苷干预后可以显著逆转上述改变。在仙茅苷组Wistar大鼠心肌中,Bax的蛋白表达水平较缺氧/复氧组和溶剂组显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平较缺血/再灌注组和溶剂组显著升高,Bcl-2/Bax的蛋白水平比值较缺血/再灌注组和溶剂组显著升高,但应用苍术苷干预后可以显著逆转上述改变。结论:1、仙茅苷可有效地改善H9c2心肌细胞的缺氧/复氧损伤和Wistar大鼠心肌的缺血/再灌注损伤。2、仙茅苷通过上调Bcl-2和下调Bax,进而抑制线粒体MPTP的开放及其下游凋亡通路的激活,从而减轻了凋亡。