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目的:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸的非编码 RNA(noncoding RNA,ncRNA)分子,在多种生物学过程中发挥重要的调节作用,但是目前对大部分lncRNA的作用及机制仍不清楚。lnc-RI是本实验室在前期研究中发现的一种新的 lncRNA分子,电离辐射后表达上调,我们将其命名为lnc-RI(lncRNA radiation induced)。本论文主要从lnc-RI对细胞电离辐射敏感性的影响、对同源重组(homologous recombination,HR)修复的影响、以及调节 RAD51基因表达的作用机制等三方面对其生物学功能进行研究,以明确lnc-RI在调节放射致DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)损伤修复过程中的作用机制。 方法:(1)用表达 lnc-RI干涉序列的 pGLV2-U6第三代慢病毒(shRNA-lnc-RI#1,shRNA-lnc-RI#2)或阴性对照病毒(shRNA-NC)感染 Hela细胞,感染后经60Coγ射线照射,通过克隆形成实验、细胞周期检测、western blot分析主要DSBs损伤修复分子表达,明确lnc-RI在辐射致DSBs损伤修复过程中的作用以及对细胞电离辐射敏感性的影响;(2)用 lnc-RI特异性 siRNA干涉序列分别转染Hela、U2OS、MCF-7、LO2等细胞,通过 western blot、间接免疫荧光法、彗星电泳等实验方法,明确 lnc-RI对正常细胞中 DSBs的影响以及下调 lnc-RI表达对HR修复核心分子表达的影响。利用 DR-GFP/I-SceⅠ报告系统分析下调 lnc-RI表达对 HR修复活性的影响。(3)用 lnc-RI干涉慢病毒感染 Hela细胞,构建 lnc-RI稳定敲低的细胞系(shRNA-lnc-RI#2)和阴性对照细胞系(shRNA-NC),用放线菌酮(cycloheximide,CHX)或放线菌素 D(actinomycin D,CHD)分别处理细胞,分析下调lnc-RI表达对RAD51蛋白及mRNA稳定性的影响。(4)通过生物信息学分析预测靶向调节lnc-RI和RAD51表达的miRNA分子,根据所预测的结合位点构建野生型(或突变型)lnc-RI及RAD513’UTR序列荧光素酶报告基因表达载体,验证hsa-miRNA-193a-3p与lnc-RI、RAD513’UTR之间的相互作用。 结果:(1)下调lnc-RI表达抑制电离辐射诱导的DSBs损伤修复,增加细胞电离辐射敏感性。下调 lnc-RI表达的 Hela细胞经60 Coγ射线照射后,克隆形成率较对照组降低、G2/M期阻滞时间延长。经γ-H2AX蛋白检测发现,下调lnc-RI抑制辐射后 DSBs损伤修复进程,同时发现下调 lnc-RI引起非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)核心作用蛋白LIG4,和多种HR修复分子RAD51、PLK1、RAD50等蛋白表达受到抑制。(2)下调lnc-RI表达引起细胞内DSBs损伤增加。下调lnc-RI表达后24h及48h, Hela、U2OS、MCF-7、LO2等细胞中γ-H2AX蛋白表达水平显著上调;间接免疫荧光实验发现下调 lnc-RI表达后,Hela及 U2OS细胞中γ-H2AX foci形成增加;中性彗星电泳结果显示,下调lnc-RI表达引起细胞尾部 DNA百分比明显增加。(3)下调 lnc-RI表达抑制细胞内 HR修复。Hela和 U2OS细胞中敲低 lnc-RI后,RAD51、 PLK1、 RAD50、BRCA1、BRCA2等 HR修复核心作用蛋白表达受到明显抑制。采用 DR-GFP/I-SceⅠ报告系统对HR修复活性进行分析发现,下调lnc-RI表达对细胞内HR修复效率产生较强的抑制作用,并伴随RAD51蛋白表达发生相应水平降低。(4)下调lnc-RI促进RAD51 mRNA降解。研究发现,在Hela、U2OS、LO2等细胞中下调lnc-RI表达能同时降低RAD51蛋白及mRNA表达水平。利用CHX和CHD分别处理 lnc-RI稳定敲低细胞系,发现下调 lnc-RI表达对 RAD51蛋白降解无明显影响,而对 RAD51 mRNA降解有显著的促进作用。(5)lnc-RI通过竞争性结合hsa-miR-193a-3p调节RAD51表达。通过生物信息学网站检索发现,lnc-RI937bp-959bp和RAD513’UTR704bp-724bp为hsa-miR-193a-3p潜在结合位点。Real-time PCR检测结果显示 hsa-miR-193a-3p能同时抑制 lnc-RI和 RAD51 mRNA表达, western blot实验发现hsa-miR-193a-3p对RAD51蛋白表达具有显著抑制作用。另外,通过双荧光素酶报告基因活性分析发现,hsa-miR-193a-3p能同时抑制表达lnc-RI和 RAD513’UTR序列的报告基因载体中荧光素酶表达,而 hsa-miR-193a-3p结合位点突变后,能够挽救 hsa-miR-193a-3p对荧光素酶表达的抑制作用,证实了hsa-miR-193a-3p与lnc-RI和RAD513’UTR之间的直接相互作用。 结论:本研究证实了lncRNA lnc-RI在调节细胞辐射敏感性和DSBs损伤修复中的作用,发现 lnc-RI参与细胞内 HR修复过程的调节,证实 lnc-RI作为内源竞争性 RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)通过 lnc-RI/hsa-miR-193a-3p/RAD51作用途径调节RAD51 mRNA稳定性。