吗啡类中枢镇痛药是临床应用镇痛效果最好的药物之一，但由于长期应用可引起机体产生依赖和耐受，因而其临床应用受到限制，并且阿片类物质的滥用或成瘾已造成日益严重的社会问题。然而，其成瘾机制目前尚不清楚，因此，对其机制的探讨已成为神经科学工作者研究的重要课题之一。 神经甾体是指在中枢神经系统合成的甾体和经血脑屏障进入神经系统发挥作用的外周甾体及其代谢衍生物的总称。最近有研究表明,神经甾体可以抑制小鼠吗啡依赖和耐受的形成，减弱戒断症状的产生，并影响大鼠条件性位置偏爱的形成，发挥其偏爱或嫌恶作用。以上研究提示神经甾体可能影响有关的药物奖赏过程。因此设想，吗啡依赖是否影响了内源性神经甾体的生物合成？内源性神经甾体是否在阿片依赖的形成过程中发挥作用？了解阿片类物质对内源性神经甾体的影响，对阐明吗啡的成瘾机制及设计对抗吗啡依赖和耐受形成的药物具有重要意义。 尽管人们通过免疫组化、原位杂交、RT-PCR 等方法已证实神经甾体合成酶在大鼠各脑区有不同程度的存在，且对于神经甾体在中枢神经系统合成与代谢的途径也已基本阐明，但是对于病理情况下神经甾体合成酶的活性表达变化却了解很少。已有研究表明，急性乙醇注射可以调节大鼠各脑区神经甾体合成与代谢的关键酶 StAR，P450scc，3β-HSD，3α-HSD mRNAs 的表达。但慢性吗啡处理是否影响神经甾体合成与代谢酶的表达未见报道，如果慢性吗啡依赖和戒断影响了大鼠脑部神经甾体的含量,那么这种变化是否与神经甾体合成与代谢酶在中枢神经系统中的表达水平调控有关尚不得而知。已知甾体合成酶的表达具有脑区特异性，那么这种区域特异性与吗啡成瘾的神经回路是否有关联？这些问题的回答对阐明阿片调节神经甾体合成与释放的机制有重要意义，同时可以通过神经甾体合成酶的兴奋剂或抑制剂调节神经甾体生成，进而达到其治疗目的。 本实验采用气相色谱-质谱联用技术，建立了一种简单、灵敏和特异 1<WP=5>中 文 摘 要性强的检测方法，可以同时测定大鼠脑组织中游离型和结合型神经甾体的含量；建立大鼠吗啡依赖、戒断和复吸模型，观察大鼠吗啡依赖、戒断和复吸时神经甾体在脑组织中含量的变化；并应用 RT-PCR 方法，观察吗啡依赖和戒断时神经甾体合成与代谢的三种关键酶 P450scc，P450c17，3β-HSD mRNAs 在大鼠脑部额叶皮质、海马、杏仁核、纹状体和中脑的表达活性，为研究内源性神经甾体与慢性吗啡成瘾的关系提供依据，旨在探讨吗啡成瘾的神经生物学机制。 主要实验结果与结论如下： 1.气相色谱-质谱联用测定大鼠脑部神经甾体 本实验建立了气相色谱-质谱联用技术测定大鼠脑组织内神经甾体的方法。游离型神经甾体孕烯醇酮（PREG）、黄体酮（PROG）、别孕烯醇酮（AP）、脱氢表雄酮（DHEA）及结合型神经甾体孕烯醇酮硫酸酯（PREGS）、脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)分两步萃取。第一步用乙酸乙酯提取游离型甾体，第二步用氯仿/2-丁醇提取甾体硫酸酯， 然后经过固相萃取方法进行纯化。甾体硫酸酯部分进行溶剂解形成游离型甾体，经溶剂解的甾体硫酸酯部分和游离型甾体部分分别与七氟丁酸酐(HFBA)进行衍生化，然后进行气相色谱-质谱分析。气相色谱以无分流方式运转，柱温升温程序从 50℃升至 150℃（30℃/min）,再升至 280℃（10℃/min）。载气 （氦气）流速为 1ml/min。气化室和界面的温度分别为 230℃和 280℃。质谱在电喷雾离子化模式下进行。根据甾体全扫描质谱图，确定神经甾体衍生物 DHEA-HFB、PREG-HFB、PROG-HFB 和 AP-HFB 的主要特征离子分别为 m/z 270、m/z 298、m/z 510 和 m/z 514。DHEA 和 DHEAS 的检测限为 1pg/μl， PREG 和 PREGS 的检测限为2pg/μl，PROG 和 AP 的检测限分别为 2pg/μl 和 5pg/μl。雄性大鼠脑部游离型神经甾体 PREG、PROG、AP、DHEA 的含量分别为 8.53±1.11ng/g,7.01±2.6ng/g, 1.17±0.19ng/g, 0.92±0.2ng/g，甾体硫酸酯 PREGS 和DHEAS 的含量分别为 5.94±2.03ng/g 和 1.93±0.92ng/g。本方法采用组合式液/液萃取分离游离型甾体和甾体硫酸酯，经固相萃取纯化，无需额外的 HPLC 纯化步骤，方法较为简便。线性范围、准确度、精密度实验显示本方法适用于同时测定大鼠脑组织中游离型和结合型甾体。 2<WP=6>中 文 摘 要 2. 吗啡依赖和戒断时大鼠脑组织内神经甾体含量的变化 本实验采用剂量递增法腹腔注射造成大鼠吗啡依赖模型，给药第 1-7天的剂量分别为 5mg.kg-1，10mg.kg-1，15mg.kg-1，20mg.kg-1，30mg.kg-1，40mg.kg-1和 50mg.kg-1,每天注射两次，共 7 天，对照组给予相同剂量的盐水，腹腔注射纳洛酮 2mg.kg-1 催促戒断反应。吗啡依赖大鼠脑组织内神经甾体 PREG、PROG 和 PREGS 的含量分别较对照组下降 62%、92%和 60%（P<0.01）。然而，吗啡对脑组织内 DHEA 和 DHEAS 的含量无显著影响。纳洛酮可诱发吗啡依赖大鼠产生明显的戒断症状，吗啡戒断大鼠脑组织内神经甾体 PREG, PR