论文部分内容阅读
目的肝癌是全球性高度恶性肿瘤,预后很差,死亡率高。目前,外科手术包括肝部分切除术和肝移植仍是治疗肝癌的有效手段,但是适合手术切除的患者仅有25%,切除后五年生存率也仅为36～50%,五年复发率高达85%。非手术治疗如经动脉导管化学栓塞治疗(TACE),经皮酒精瘤内注射(PEI),放疗,射频消融治疗(RFA)微波凝固治疗(MCT),激光热疗,中医中药等,方法虽然很多,但均不能达到令人满意的疗效。因此,对于肝癌尤其是中晚期肝癌患者,探索更为有效的治疗手段至关重要。肿瘤发病机制及靶向基因治疗是近年来研究的热点,发现了许多与肝癌发病相关的靶分子,但缺乏高度的特异性。因此寻找参与绝大多数肝癌发病的关键性特异分子靶是现阶段肝癌基因治疗迫切需要解决的问题。遗传印记基因PEG10是来源于病毒反转录转座子的父系表达的印记基因。本实验室的前期研究结果显示,PEG10在肝癌组织中的表达具有比AFP更高的特异性。本实验中检测PEG10基因mRNA和蛋白在包括肝癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌及宫颈癌等多种人肿瘤细胞株中的表达情况,并采用RNAi技术,设计针对PEG10基因的siRNA真核表达载体,研究其对PEG10基因的抑制作用及在体内外对肝癌生长的影响,为探讨PEG10作为肝癌基因治疗的新的特异性靶点奠定实验基础。方法RT-PCR和Western Blot分别检测PEG10基因mRNA和蛋白在人肝癌细胞株、胰腺癌细胞株、大肠癌细胞株,乳腺癌细胞株及宫颈癌细胞株中的表达情况。根据PEG10基因cDNA序列,设计针对PEG10基因的4个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。将构建好的4个重组质粒分别命名为psiRNA1, psiRNA2, psiRNA3和psiRNA4,通过脂质体瞬时转染肝癌细胞后,RT-PCR和实时定量PCR,检测其对肝癌细胞PEG10基因mRNA表达的影响,Western Blot检测转染后PEG10蛋白表达的改变,同时检测转染后细胞周期相关因子包括Cyclin (cyclin D), CDKI (p21, p27 and p16), CDK (CDK4)和E2F1的mRNA和蛋白表达情况。MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染后的肝癌细胞的增殖,凋亡及细胞周期变化。在体外抗肝癌研究的基础上,应用培养的HepG2细胞建立人肝癌荷瘤裸鼠模型,在肝癌细胞接种后第14天分别将空载体和重组质粒psiRNA2瘤内多点注射进行治疗,观察肿瘤大小变化,组织形态学及超微病理改变。结果肝癌细胞、胰腺癌细胞和大肠癌细胞中PEG10基因mRNA和蛋白均高表达,而乳腺癌细胞和宫颈癌细胞中未检测到PEG10基因mRNA和蛋白的表达。成功构建了4个特异性siRNA表达载体,分别转染肝癌细胞后,均不同程度地抑制了肝癌细胞PEG10基因mRNA的表达,转染后48小时psiRNA2抑制效率最高。同时CDKI(p21和p16)mRNA表达升高, E2F1, Cyclin和CDK表达降低。Western Blot结果显示PEG10和CDKI蛋白水平升高,而E2F1, Cyclin和CDK蛋白水平降低。肝癌细胞的生长也明显受到抑制(P<0.05),而乳腺癌细胞和宫颈癌细胞生长未受影响。流式细胞仪分析转染后的细胞在细胞周期各时相的分布发生明显改变,G0/G1期细胞增多,发生G1/S期阻滞,大量HepG2细胞凋亡。激光共聚焦显微镜观察到三种肝癌细胞典型的凋亡细胞形态。以皮下接种培养肝癌细胞的方法成功建立人肝癌荷瘤裸鼠模型,经psiRNA2、空质粒和生理盐水多点瘤内注射,psiRNA2治疗组肿瘤生长受到明显抑制,与生理盐水组和空质粒组比较有明显差异(P<0.001),抑瘤率明显高于其他两组,电镜下可见明显的细胞凋亡。结论PEG10基因在肝癌细胞中高表达,在消化系肿瘤以外的其他肿瘤如乳腺癌和宫颈癌细胞中不表达。成功构建针对PEG10的4个真核表达载体,其中psiRNA2的抑制效果最佳,转染肝癌细胞后可明显降低PEG10基因mRNA和蛋白的表达,抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,影响肝癌细胞周期的分布,使肝癌细胞发生G1/S期阻滞,同时对裸鼠肝癌移植瘤生长有抑制作用。因此,靶向PEG10的siRNA真核表达载体可能成为肝癌基因治疗的新手段。