由于寄主植物种类多、繁殖和迁飞能力强以及具有兼性滞育等生物学特性,棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)已成为一种全球性的重要害虫。棉铃虫对现有主要类型的杀虫剂都产生了抗性,是目前世界上杀虫剂抗性报道最多的害虫之一。其中拟除虫菊酯杀虫剂抗性在棉铃虫中较早报道,也是最严重的抗性类型之一。众多研究发现,棉铃虫拟除虫菊酯抗性的产生主要与细胞色素P450介导的解毒代谢能力提升有关,但大部分的研究仅关注于昆虫氧化代谢能力的增强和个别P450基因转录水平的提高。细胞色素P450作为昆虫体内重要和复杂的酶系,其基因数量多且功能多样化,但很多棉铃虫细胞色素P450基因与抗药性表型之间的因果关系缺乏系统研究和直接证据。本文根据公布的棉铃虫基因组信息,对其中108个细胞色素P450基因进行了整理和系统发育分析,发现Clan2和ClanM中P450基因进化较为保守,大多与家蚕体内P450基因呈1:1直系同源关系,Clan3和Clan4中的P450基因则发生了扩增,推测这种现象可能与外源化合物解毒代谢相关。通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)对目前已经报道的与棉铃虫拟除虫菊酯抗性相关CYP6B和CYP9A以及与多种外源化合物代谢相关的CYP6AE共三个亚家族的21个细胞色素P450基因进行了体外表达和功能验证;对序列相似度较高但顺式氰戊菊酯代谢能力差异大的几对CYP6AE P450的一级和二级结构进行了比对和分析,通过互换底物识别位点(SRS)构建P450融合基因并进行功能表达。这一系列研究的结果提供了棉铃虫CYP6B和CYP9A亚家族多个P450基因与氰戊菊酯抗性之间关系全面和直接的证据,并首次发现了棉铃虫CYP6AE亚家族P450具有代谢多种杀虫剂的能力以及CYP6AE P450底物识别位点影响P450蛋白的结构稳定性和代谢顺式氰戊菊酯的能力。为棉铃虫细胞色素P450介导的拟除虫菊酯抗性研究以及昆虫细胞色素P450结构与功能关系的研究提供了新的证据。具体结果如下:1.棉铃虫细胞色素P450基因的系统发育分析本研究从公布的棉铃虫参考基因组数据中,获取了 114个细胞色素P450基因序列,对其重新进行整理后得到105个正确的细胞色素P450基因,并根据基因组上的位置信息绘制成物理图谱;并对比家蚕83个细胞色素P450基因,对棉铃虫108个细胞色素P450基因(加上未在参考基因组中注释的CYP9A12、CYP9A18和CYP33 7B3)进行了系统发育分析。结果表明,棉铃虫细胞色素P450基因分布在21条染色体上,可分为4个Clan(2、3、4、M)、28个细胞色素P450基因家族和55个细胞色素P450基因亚家族。其中Clan2中有8个基因,ClanM中有10个基因,Clan3中有48个基因,Clan4中有42个基因。Clan2和ClanM中的细胞色素P450基因进化较为保守,多数与家蚕细胞色素P450基因保持1:1直系同源关系。Clan3和Clan4中的细胞色素P450基因发生了大量扩增,这些发生扩增的基因家族或亚家族在多条染色体上形成了10个超过3个基因的亚家族,其中部分基因证实可能与外源化合物解毒代谢相关。这些结果首次系统地描述了棉铃虫基因组上细胞色素P450基因的分布和分类,为今后棉铃虫P450基因功能和进化的全面研究奠定了基础。2.棉铃虫CYP6B和CYP9A亚家族P450基因的功能表达根据目前的报道,棉铃虫Clan3和Clan4中多个P450基因在拟除虫菊酯抗性品系体内组成性上调或诱导上调,且主要属于CYP6B和CYP9A亚家族。但其中仅有CYP6B6、CYP6B7、CYP9A12和CYP9A14被证实具有代谢顺式氰戊菊酯的能力。通过基因组数据发现CYP6B和CYP9A亚家族中有12个P450基因,较高的基因序列相似度是否意味着具有相同的解毒代谢能力?所以本实验通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统,对棉铃虫CYP6B和CYP9A两个P450亚家族的11个基因进行了克隆和功能表达。体外代谢结果显示,除了 CYP6B43不能代谢顺式氰戊菊酯外,CYP6B和CYP9A亚家族的所有成员均可以在体外代谢顺式氰戊菊酯。在相同条件下,CYP6B6的代谢速率最高,达到 0.46 pmol 4’-OH product/min/pmol P450;CYP9A18 次之,代谢速率为 0.3 pmol 4’-OH product/min/pmol P450;CYP6B2 的代谢速率最低,为 0.01 pmol 4’-OH product/min/pmol P450。在代谢产物检测中还首次发现了2’-羟基顺式氰戊菊酯,其中CYP9A12的体外代谢产物以2’-择基顺式氰戊菊酯为主。本研究证实了棉铃虫细胞色素CYP6B和CYP9A亚家族的多个P450具有代谢顺式氰戊菊酯的能力,预示着这些细胞色素P450基因的表达上调对棉铃虫氰戊菊酯抗性具有潜在的贡献。3.棉铃虫CYP6AE亚家族P450基因的组织表达模式、进化分析和功能表达棉铃虫CYP6AE亚家族有10个P450基因,其中9个在16号染色体上形成首尾相连的基因簇,氨基酸序列相似度最高达到91.8%。众多研究表明,棉铃虫CYP6AE亚家族中超过半数的P450基因可以被包括拟除虫菊酯和棉酚在内的多种杀虫剂和植物次生性物质所诱导,很可能在棉铃虫体内参与这些化合物的代谢,但仅有的CYP6AE14体内和体外的功能验证结果却不一致。进化分析表明,棉铃虫、美洲棉铃虫和家蚕的CYP6AE亚家族P450基因具有很保守的共线性关系和很近的系统发育关系。在棉铃虫中CYP6AE14和CYP6AE18为最新产生的基因,CYP6AE19/20进化枝为分歧最早的棉铃虫CYP6AE基因。定量PCR检测发现,CYP6AE12、CYP6AE14和CYP6AE19的表达具有组织特异性,CYP6AE12和CYP6AE19主要在脂肪体中表达而CYP6AE14则主要在中肠细胞内表达;CYP6aE11在中肠和脂肪体中均有相对最高的表达丰度,CYP6AE20在两个器官中则几乎没有表达。体外代谢实验结果表明,除了 CYP6AE20外,其余9个CYP6AE亚家族P450可以代谢顺式氰戊菊酯,其中CYP6AE11的代谢速率最快(Vmax=2.3 pmol/min/pmol P450),CYP6AE14 的代谢效率最高(Vmax/Km=0.51)。同样,除了 CYP6AE20之外的9个CYP6AE亚家族P450可以代谢艾氏剂,其中CYP6AE12的代谢速率最高,达到0.45 pmol/min/pmol P450。此外,有7个CYP6AE亚家族P450可以代谢吡虫啉,但相同条件下代谢速率最高的CYP6AE19只有阳性对照CYP6CMlvQ代谢速率的1/10。所有的CYP6AE亚家族P450均不能在体外降解棉酚。本实验首次明确了棉铃虫CYP6AE亚家族具备多种杀虫剂的代谢能力但不能代谢棉酚。结合之前发表的研究结果,证明棉酚仅有限地参与棉铃虫CYP6AE亚家族P450基因的进化且该亚家族P450很可能通过诱导上调的方式参与棉铃虫氰戊菊酯抗性的形成。4.棉铃虫CYP6AE P450底物识别位点SRS1和SRS6对顺式氰戊菊酯代谢能力的影响棉铃虫CYP6AE亚家族P450具有较高的序列相似度但杀虫剂代谢能力却相差甚远。本研究对代谢速率最高的CYP6AE11和与之系统发育关系较远但丧失代谢能力的CYP6AE20,以及系统发育关系很近但代谢效率相差约8倍的CYP6AE17和CYP6AE18,进行了一级序列比对和二级结构的分析。在6个底物识别位点(substrate recognition sites,SRS)中,发现这两对细胞色素P450基因在SRS1和SRS6区域序列相似度最低。本研究通过互换CYP6AE11-CYP6AE20的SRS1 区域,以及CYP6AE17-CYP6AE18的SRS1和SRS6区域,共构建六个P450融合突变体并进行了功能表达。结果显示,互换底物识别位点后个别P450突变体蛋白结构受到影响,CYP6AE11-20SRS1突变体无法通过还原型CO差光谱检测到正确折叠的蛋白,CYP6AE17两个突变体重组蛋白中P420含量较高,CYP6AE20-11SRS1最大吸收峰出现在457nm处。这6个融合突变体的顺式氰戊菊酯代谢能力发生了巨大的变化。CYP6AE20-11SRS1 突变体获得了中低水平的顺式氰戊菊酯代谢能力(Vmax/Km=0.05),CYP6AE11-20SRS1突变体虽然无法通过还原型CO差光谱检测到含量极低的正确折叠蛋白,但仍保持有低水平的代谢能力和较高的亲和力(Km=6.6μM)。CYP6AE18替换了 CYP6AE17的SRS1和SRS6后,两个突变体代谢效率有了大幅提升(Vmax/Km分别是0.25和0.4),甚至超过野生型CYP6AE17(Vmax/Km=0.27),而CYP6AE17两个突变体的代谢活性出现2倍和13倍的下降。这些结果证明了 SRS1和SRS6区域的改变会影响棉铃虫CYP6AE亚家族P450的蛋白结构和对顺式氰戊菊酯代谢能力,表明这两个区域序列的多态性是造成棉铃虫CYP6AE亚家族P450功能分化的直接原因之一。本研究为昆虫细胞色素P450结构与功能的关系研究做出了有益的探索。