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【背景和目的】CAR(Chimeric Antigen Receptor)是一种能够特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合受体,利用基因工程技术将其与T细胞的活化基序结合,即将抗体对肿瘤抗原的高亲和性与T淋巴细胞的杀伤机制相结合,使T细胞表达特异性的CAR,从而具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力。特异性CAR修饰的T淋巴细胞靶向治疗肿瘤是近年来免疫治疗的热点。CAR结构自1989年起,不断改进,已发展到第4、5代,但是目前研究较多的仍然为第二代和第三代CAR。第三代CAR与第二代CAR不同之处在于同时融合了两种共刺激分子,可提高T细胞的细胞毒性和增殖活性,但同时也可能增强对正常组织的破坏。目前应用于临床试验的多数为第二代CAR,第三代CAR是否优于第二代CAR仍有待验证。磷脂酰肌醇聚糖(glypican-3,GPC3)在原发性肝癌中表达上调,在正常肝组织、肝良性病变及癌旁组织中不表达,因其在肝癌中的这种特异性表达而成为近年来肝细胞癌免疫治疗的热门靶点。本研究在前期构建的第三代嵌合抗原受体慢病毒表达载体GPC3-CAR(以下简称LV-GPC3-G3)的基础上进一步设计第二代GPC3-CAR(以下简称LV-GPC3-G2),感染人T淋巴细胞,观察其对肝癌细胞的体外杀伤作用,比较第二代及第三代GPC3-CAR T细胞抗肝癌的有效性及靶向性,为GPC3-CAR修饰的T淋巴细胞应用于肝癌治疗提供实验基础。【方法】1.将GPC3单链抗体sc Fv与4-1BB和CD3ζ片段连接,构建第二代抗GPC3单链抗体的嵌合抗原受体慢病毒表达载体LV-GPC3-G2。2.通过测序及双酶切验证后,与慢病毒包装质粒REV、RRE及VSVG共转染293FT细胞包装成慢病毒,ELISA法测定病毒滴度。3.抽取健康人外周血,T细胞分选磁珠分选T淋巴细胞,用细胞因子优化培养T淋巴细胞。LV-GPC3-G2、LV-GPC3-G3、空载体对照组LV-MOCK分别感染T细胞(以下简称G2、G3、MOCK),流式细胞术检测病毒感染效率和T细胞存活率,Western-blot检测目的蛋白GPC3的表达。4.培养肝癌细胞株Hep G2、Huh7、HCC-LM3、Hep3B、SK-HEP-1、97H、97L,PCR检测GPC3的表达情况,筛选GPC3不同阳性表达和不表达的肝癌细胞株进行杀伤实验。5.杀伤实验:以T淋巴细胞为效应细胞,肝癌细胞为靶细胞行杀伤实验。分为以下四组:(1)LV-GPC3-G2修饰的T淋巴细胞;(2)LV-GPC3-G3修饰的T淋巴细胞;(3)空病毒载体LV-MOCK感染的T淋巴细胞;(4)未感染的T淋巴细胞;分别与肝癌细胞共孵育,CCK8试剂盒及Annexin V/7-AAD流式细胞术检测肝癌细胞凋亡,进而判断GPC3-CAR T细胞对肝癌细胞的杀伤效率。6.ELISA检测细胞因子分泌:在效靶比为10:1,杀伤时间24h时,吸取上清液,使用Quantikine ELISA方法检测各组T淋巴细胞杀伤肝癌细胞后上清液中细胞因子IFN-g及IL-2的分泌情况,进一步评价GPC3-CAR T细胞对肝癌细胞的杀伤效率。【结果】1.经双酶切鉴定,测序分析证实成功构建第二代慢病毒表达载体LV-GPC3-G2。2.用Lip3000试剂盒包装慢病毒,ELISA法检测病毒滴度为2.0×108TU/m L。3.IL-2(300U/m L)、Human T-Activator CD3/CD28 beads(25μl/1×106细胞)优化培养T淋巴细胞,T淋巴细胞可稳定培养42天。20MOI的LV-GPC3-G2、LV-GPC3-G3分别感染人T淋巴细胞,流式细胞术检测LV-GPC3CAR在T淋巴细胞的表达率(G2感染率(%)69.70±0.3345,细胞存活率(%)85.53±0.1392;G3感染率(%)69.40±0.2573,细胞存活率(%)87.31±0.1090)。Western-blot证实感染后的T细胞可正确表达第二代及第三代GPC3-CAR。4.PCR检测肝癌细胞株GPC3的表达,阳性表达GPC3肝癌细胞株Hep G2>Hep3B>Huh-7>Hcc-LM3>97H>97L,而SK-HEP-1不表达GPC3。5.四组T淋巴细胞分别与肝癌细胞Hep G2、Huh7、SK-HEP-1共孵育,与对照组相比,第二代及第三代GPC3-CAR修饰的T淋巴细胞均对表达GPC3的肝癌细胞有较高的杀伤效率:Hep G2组P=0.016(G2 vs.MOCK),P=0.018(G3 vs.MOCK);Huh7组P=0.023(G2 vs.MOCK),P=0.027(G3 vs.MOCK)。针对SK-HEP-1则未见明显杀伤作用(P>0.05)。对不同肝癌细胞,两代GPC3-CAR T细胞的杀伤效率Hep G2>Huh-7>SK-HEP-1,与肝癌细胞GPC3表达率呈正相关。针对同一种肝癌细胞,第二代GPC3-CAR T细胞的杀伤效率略高于第三代GPC3-CAR T细胞,但两代GPC3-CAR T细胞的杀伤效率并无明显差异(P>0.05)。6.检测杀伤后上清液中细胞因子IFN-g及IL-2的分泌情况,表达GPC3的肝癌细胞Hep G2和Huh7组,经第二代及第三代GPC3-CAR T细胞杀伤后,细胞因子IFN-g及IL-2分泌量均明显高于对照组SK-HEP-1(P<0.05)。【结论】成功构建第二代GPC3嵌合抗原受体慢病毒表达载体LV-GPC3CAR;优化人外周血T淋巴细胞的培养,第二代及第三代LV-GPC3CAR均成功感染T淋巴细胞,并在体外稳定培养扩增。经第二代和第三代GPC3-CAR修饰的T淋巴细胞均能高效特异性杀伤GPC3阳性的肝癌细胞,杀伤效率与肝癌细胞GPC3表达率呈正相关;两代GPC3-CAR T对肝癌细胞的杀伤效率无明显差异。