糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的严重并发症之一,可以导致严重的终末期肾衰竭。肾小球肥大是DN早期的特征性病理变化,主要累及肾小球系膜细胞(MC)和内皮细胞,进一步发展将导致肾小球纤维化与硬化。脂氧化酶(lipoxygenase,LO)是一组不含有血红素铁的氧合酶,能够将氧分子插入包括:花生四烯酸和亚油酸为代表的多聚不饱和脂肪酸内。根据插入氧分子的碳原子位置的不同,LO分为5-LO、8-LO、12-LO和15-LO。12-LO能够氧化产生包括12(S)-多聚不饱和花生四烯酸(HETE)。其中由于人与家兔的白细胞型12-LO与15-LO具有高度同源性,而且都能够代谢产生12(S)-HETE和15(S)-HETE,统称为12/15-脂氧化酶(12/15-LO)。近年来,研究发现12/15-LO代谢途径参与了动脉粥样硬化、高血压等疾病的发生发展而备受关注。研究结果表明,在糖尿病动物的肾小球MC和血管平滑肌细胞内12/15-LO的表达明显增加,其活性代谢产物12(S)-HETE的分泌也显著高于正常值;而且研究发现12(S)-HETE具有重要的促增殖及炎性因子作用,特别是在血管内皮和肾脏细胞中;它们可以引起肾小球系膜细胞及血管内皮细胞发生肥大,促进细胞外基质蛋白、纤维蛋白以及粘附基因的大量表达;并且高糖环境下这种促进细胞外基质增生和细胞肥大的作用显著增强。在信号转导通路的研究中发现,12/15-LO的代谢产物能够激活包括MAPK信号转导系统中的细胞外信号调节激酶(ERK)和p38信号途径,并介导了一些生长因子和细胞因子的生物活性。另外,研究表明LO的活性增加能够导致细胞内一氧化氮(NO)的消耗,这是LO参与诱导肾脏疾病、动脉硬化和高血压的另一个重要致病机制。在本项实验中,我们应用来源于WT小鼠和12/15-LOKO小鼠的肾小球MC作为研究对象,发现将12(S)-HETE加入正常的MC培养液中能够诱导细胞发生肥大,而将12/15-LOKO小鼠MC与正常细胞同时在低糖或高糖环境下培养后发现,高糖引起的细胞肥大在12/15-LOKO中明显受到抑制,间接证明了12/15-LO与细胞肥大发生的关系。在动物实验中,将12/15-LOKO与C57B6小鼠同时诱导1型糖尿病模型,血糖升高16wk后观察两组小鼠尿蛋白水平、肾脏体积、肾小球体积以及肾功能指标,发现12/15-LOKO小鼠24h尿蛋白量及尿白蛋白水平显著低于对照组;反映肾脏体积和肾小球大小的结果表明高糖导致的肾小球及肾脏肥大在12/15-LOKO小鼠发生程度明显低于对照组。因此,无论是细胞实验还是动物体内研究结果均表明,12/15-LO与糖尿病性肾脏肥大的病理变化密切相关,是导致DN进展的重要致病因素;控制12/15-LO的表达有利于减轻肾细胞肥大、延缓DN的进展。研究表明,细胞增殖、肥大与凋亡的调节最终都发生在细胞周期水平上。细胞周期是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。细胞周期具有单向性和阶段性,细胞可因某种原因在某时相停滞下来,待生长条件好转后,细胞可重新活跃起来过渡到下一时相。细胞周期的调控由细胞周期调控蛋白完成,按其功能分为正调控蛋白和负调控(抑制)蛋白。正控蛋白包括细胞周期素和周期素依赖蛋白激酶,具有促进细胞周期进程的作用。细胞周期负控蛋白:又称周期素依赖激酶抑制物(CDKI)。这些负控蛋白可结合CDK而抑制全酶活性,影响DNA复制从而抑制细胞增生。根据结构和所抑制的cyclin-CDK复合物的不同,CDKI分为INK4家族和CIP/KIP家族。其中CIP/KIP家族包括p21、p27、p57等,可抑制已知的大多数cyclin-CDK复合物的激酶活性,对G1期的早期与晚期、S期等都有重要作用,且分布与功能在不同的细胞各异,是目前的主要研究对象。糖尿病时细胞肥大的发生与G1/S周期逃逸有关;而发生机制研究表明CDKI中p21与p27蛋白的过度表达是引起G1/S期逃逸的重要原因。因此推测12/15-LO代谢途径通过参与调节p27和p21的表达而诱导细胞肥大。实验中我们发现12/15-LO的代谢产物12(S)-HETE能明显上调MC内p21和p27蛋白水平。在稳定高表达12/15-LO基因的MC内p21和p27蛋白水平也高于对照组;而应用12/15-LOKO和正常对照的MC分别在低糖和高糖环境培养下发现:12/15-LOKO细胞内p21和p27蛋白在高糖刺激下的上升水平明显低于对照组细胞;动物实验中我们也发现12/15-LOKO小鼠在诱导糖尿病后,肾脏皮质内及分离的肾小球内的p21和p27蛋白的上升水平明显低于C57B6小鼠。综合上述结果,可以得出12/15-LO能够调控p21和p27蛋白的表达,是导致DN时p21与p27在肾脏内高表达的原因之一。在p21表达调节的机制中,转录性调控起着主要的调节作用。其中,p53是调控p21转录活性最重要的转录因子,在细胞内p53蛋白水平以及与目标DNA序列结合的能力都会影响p21基因的表达。研究表明,p53蛋白15位丝氨酸(serine 15)的磷酸化能够抑制p53蛋白降解、增加蛋白稳定性而促进p53蛋白在细胞内的表达;因此p53蛋白的磷酸化水平也参与p21基因的表达调控。本项目中我们观察到12(S)-HETE刺激上调了p21基因mRNA水平,12/15-LO基因敲除明显抑制了高糖刺激引起的p21mRNA的表达;提示12(S)-HETE能够转录性调控p21基因的表达。同时,应用12(S)-HETE能够明显使细胞核内p53蛋白表达以及磷酸化水平明显增加,说明12(S)-HETE相关的p21基因调控为p53依赖性。为了进一步证明12(S)-HETE转录性调控p21表达的作用机制,我们构建了含有正常p21启动子序列(-4542～+133bp,WT)和p53结合位点(-2815～-2796)和(-1923～-1904)处点突变处理的荧光素酶报告基因载体(M1、M2)并进行细胞转染。应用12(S)-HETE刺激细胞后发现,转染WT载体的细胞内p21转录活性显著增加,表明12(S)-HETE具有转录性增加p21的表达作用;而与WT载体相比,转染突变载体M1和M2的细胞经12(S)-HETE处理后12(S)-HETE引起的p21转录活性增加明显受到抑制;进一步说明了p53与p21启动子的结合是12(S)-HETE控制p21表达的重要机制。与p21的转录性调控机制不同, p27的调控主要发生在转录后水平包括影响蛋白的翻译及降解;另外翻译后水平的磷酸化修饰以及细胞内定位也会影响p27的表达与发挥功能。在对p27基因的调控机制研究中,我们发现12(S)-HETE除了能够增加p27蛋白的表达,还能够诱导细胞内p27在核内的聚集。免疫荧光结果显示,静息期细胞内p27在核内聚集;利用15%的血清使静息期细胞发生分裂,发现增殖细胞内p27由静息期时的细胞核内转移至胞浆中;当加入12(S)-HETE刺激后,定位于胞浆中的p27蛋白再次转移至细胞核中,表明12(S)-HETE能够诱导p27蛋白在细胞核内聚集而发挥抑制细胞周期进程的作用。在对细胞肥大相关的细胞周期逃逸的研究中发现,p38MAPK信号通路与G1/S周期逃逸及细胞肥大的关系最为密切。12(S)-HETE能够激活p38MAPK信号途径,诱导细胞肥大和ECM成分合成;而应用特异性p38MAPK通路阻断剂SB202190能够抑制12(S)-HETE的这些生物作用。在本项研究中,应用SB202190预处理后细胞内由12(S)-HETE刺激引起的p21和p27蛋白水平升高明显受到抑制;而对照组应用ERK通路阻断剂U0126则无此作用。这些结果也进一步证实12-LO通过激活p38MAPK通路诱导细胞内p21和p27蛋白的高表达而引起细胞肥大的发生。由于12(S)-HETE能够诱导Smad2/3发生磷酸化,并且促进细胞内TGF-β的表达;另外研究显示除了经典的Smad信号途径,TGF-β还能活化包括ERK、p38和JNK在内的MAPK信号系统;因此12(S)-HETE相关的p38MAPK与Smad途径的活化可能与其介导的TGF-β表达增加有关。研究结果表明,应用TGF-β中和性抗体和受体拮抗剂能够降低12(S)-HETE介导的Smad2/3蛋白磷酸化水平;而对于12(S)-HETE介导的p38MAPK磷酸化水平二者均无显著作用,说明12(S)-HETE介导的p38MAPK活化与TGF-β的活化及表达无关。因此可以说12(S)-HETE通过激活p38MAPK和Smad途径来诱导p21和p27蛋白的表达。综合上述实验结果,本项研究首次证明了氧化性不饱和脂肪酸代谢产物在糖尿病性肾小球肥大的病理变化中的促进作用和发生机制,发现脂氧化酶代谢途径与关键性病理因子TGF-β具有相互作用、互相激活并促进下游调控因子的表达,进而引起糖尿病性病理改变的进展。为延缓糖尿病性并发症特别是糖尿病肾病及相关性肾功能衰竭并发症,提供了一个新的治疗靶点和研究方向。