论文部分内容阅读
植物病毒是胞内寄生病原物,可严重危害农作物的生产,防治难度较大。生产上,除种植抗病毒品种外,抗病毒剂的应用是目前防治植物病毒病的一个主要选择。为应对实际生产环境中,病毒病害的复杂态势,开发高效绿色的新型抗病毒制剂成为当前研究热点。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)为防治对象,将抗病毒活性物质槲皮素与纳米技术结合,围绕着新型植物抗病毒剂开发进行了系统研究。本研究首先制备了槲皮素纳米脂质体。以槲皮素,卵磷脂和胆固醇为原料,吐温80为表面活性剂,壳聚糖季铵盐为稳定剂,采用薄膜超声法成功制备槲皮素纳米脂质体。并对其形态、粒径、PDI、Zeta电位和包封率进行测定,利用傅里叶红外变换光谱分析和透射电镜观察研究脂质体修饰前后结构的变化。同时确定壳聚糖季铵盐的最佳浓度,并分别从pH、温度和贮藏时间对槲皮素释放率的影响,研究纳米脂质体的稳定性。结果表明:(1)制备的包覆槲皮素的载药体系为槲皮素纳米脂质体,载药体系水溶液固定体系为100 mL,槲皮素初始量10 mg,槲皮素、卵磷脂、胆固醇的质量比为1:10:2,在此体系下制备的纳米脂质体具有较好的品质。(2)优化处方所得H-TQ-NPs包封率为88%,平均粒度300 nm,Zeta电位+38.5 mV,PDI指数为0.31。(3)壳聚糖季铵盐的最佳浓度为0.3 g/L,有助于提高H-TQ-NPs的稳定性。(4)低温(4℃)避光和弱酸性(pH=6.0)的储存条件有利于H-TQ-NPs在20 d内保持稳定。为进一步测定槲皮素纳米脂质体(Q-NPs)抗病毒活性,本研究采用本氏烟-TMV模型,以TMV CP蛋白的mRNA相对积累量为指标,明确了0.1 mM/L槲皮素间隔12 h喷施本氏烟两次可有效抑制TMV的侵染和复制。通过Western Blot和qRT-PCR检测表明Q-NPs分别在基因水平和蛋白水平上对TMV的抑制效果比同浓度游离态槲皮素高10%和42%。药害对比分析结果显示,Q-NPs水溶液对本氏烟与三生烟安全,喷施后均未产生药害与叶片畸形。为进一步探明槲皮素抗病毒作用机制,基于NCBI数据库,本研究选取本氏烟Hsp70家族中亚细胞定位不同的6个基因作为研究对象,分别为NbHsp70er-1(定位于内质网)、NbHsp70cp-1(定位于叶绿体)、NbHsp70、NbHsp70c-A、NbHsp70c-B、NbHsp70c-C(定位于细胞质)。通过qRT-PCR的方法研究Q-NPs对6个基因表达的影响。通过非生物胁迫发现NbHsp70cp-1和NbHsp70c-A响应热胁迫上调表达,其余基因的表达量无显著改变。且经Q-NPs提前处理可减少NbHsp70cp-1的上调,抑制其对热胁迫的响应。生物胁迫(TMV侵染)试验结果表明TMV复制时NbHsp70er-1和NbHsp70c-A上调表达,其余基因的表达量无显著改变;接种TMV后施用Q-NPs,可检测到NbHsp70er-1和NbHsp70c-A的表达下调,且Q-NPs处理抑制TMV复制。结果表明Q-NPs处理可下调NbHsp70cp-1、NbHsp70er-1和NbHsp70c-A的表达,而不同细胞器Hsp70的表达有益于多种病毒复制,因此槲皮素纳米脂质体可通过抑制对应的Hsp70的表达来达到防控多种病毒病的效果。试验研究了Q-NPs防治TMV的可能机理,Q-NPs抑制TMV复制诱导的NbHsp70er-1和NbHsp70c-A的表达,从而在发病早期减少TMV的积累。