新型纳米酶阵列传感器的构建及其在疾病诊断中的应用研究

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阵列传感器利用多个传感单元与分析物之间的交叉反应产生的差异性响应信号,结合机器学习等数据处理方法,实现多种目标物同时测定和区分,具有操作简单、响应迅速、检测通量高等优点。石墨烯量子点(GQDs)是一种新兴的碳基纳米材料,除了具有优异的光学和电学特性外,还因其独特的模拟酶催化活性,在生物传感、疾病诊疗等方面应用广泛。本文基于具有模拟过氧化物酶活性的GQDs,设计不同的光学阵列传感器,用于生物标志物(硫醇、细胞外泌体)的区分和检测,实现疾病的早期诊断。本论文主要开展以下两方面研究工作:一、基于金属离子调控的石墨烯量子点纳米酶构建阵列传感器用于硫醇区分和疾病鉴别本章工作以具有模拟过氧化物酶活性的对苯二甲酸功能化石墨烯量子点(TPA@GQDs)为基础材料,通过三种金属离子(Fe2+、Cu2+和Zn2+)调控TPA@GQDs的催化活性,构建三通道纳米酶阵列传感器,实现六种硫醇的准确区分和检测。TPA@GQDs作为一种纳米酶可以催化过氧化氢(H2O2)氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB),在650 nm处产生特征吸收峰。具有不同芬顿活性的三种过渡金属离子(Fe2+、Cu2+和Zn2+)能够与TPA@GQDs表面丰富的羟基配位,诱导形成金属离子调控的催化活性中心,使得金属离子-TPA@GQDs集成体的催化活性获得不同程度的提升。在硫醇存在下,硫醇与金属离子之间较强的亲和力促使羟基释放,在不同程度上抑制传感单元的催化活性。在TMB-H2O2显色体系中,每个传感单元针对不同硫醇会产生差异性的比色信号(即指纹图谱)。采用机器学习方法对所得“指纹图谱”进行数据处理,可实现六种硫醇(半胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、二硫苏糖醇、6-巯基己醇、巯基乙酸)的准确区分,检出限为50 n M。此外,该纳米酶阵列传感器还可对不同浓度的同种硫醇以及硫醇混合物进行检测和区分,并具有良好的抗干扰性能。为了评估该阵列传感器在实际应用中的可行性,根据不同类型实际样本中硫醇含量的差异,实现了多种疾病的准确鉴别。该纳米酶阵列传感器操作简单、成本低,在疾病的早期诊断中具有巨大的应用潜力。二、基于DNA花型结构封装Fe2+/TPA@GQDs构建比色/光热双模式生物传感器用于外泌体检测和癌症诊断本章工作基于双适体识别策略,以Ep CAM适体修饰的磁珠为外泌体捕获探针,以封装Fe2+/TPA@GQDs的DNA花型结构(Fe2+/TPA@GQDs@DFs)为外泌体识别探针,构建一种“磁珠捕获探针-外泌体-Fe2+/TPA@GQDs@DFs识别探针”三明治结构,实现比色/光热双模式外泌体检测;通过改变捕获适体探针类型,构建阵列传感器用于癌症诊断。将与外泌体结合的CD63适体的互补序列设计到环模板中,基于滚环扩增(RCA)反应自组装形成DNA花型结构(DFs),并在RCA过程中封装Fe2+修饰的TPA@GQDs纳米酶(Fe2+/TPA@GQDs@DFs),作为外泌体识别探针的同时,也提升了Fe2+/TPA@GQDs的稳定性。将捕获外泌体(He La细胞来源)的一条核酸适体链Ep CAM固定在磁珠上,基于双适体识别策略,构建“磁珠捕获探针-外泌体-Fe2+/TPA@GQDs@DFs识别探针”三明治结构。在酸性的TMB-H2O2体系下,DFs裂解释放Fe2+/TPA@GQDs,表现出良好的模拟过氧化物酶活性,导致体系在650 nm处出现氧化态TMB的特征吸收峰,进一步在近红外光照射下产生光热效应,基于此设计一种比色/光热双模式生物传感器用于He La细胞来源外泌体检测;利用光热促进纳米酶催化活性的特点,显著提高比色检测模式的灵敏度,检出限为1300 particles m L-1,并成功实现宫颈癌患者血清中外泌体的准确测定。基于不同细胞来源外泌体表面蛋白质的种类和表达的差异,选用三种适体链(HER2、MUC1、GPC3)修饰的磁珠作为捕获探针,基于“磁珠捕获探针-外泌体-Fe2+/TPA@GQDs@DFs识别探针”三明治结构,构建三通道阵列传感器,成功实现不同种类癌症以及肝炎和肝癌的准确区分和鉴别,为癌症的早期诊断提供新思路和方法。
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