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目的:制备特定粒径范围的活性炭纳米粒子(activated carbon nanoparticles,ACNP)与二甲双胍(metformin,MET)构建ACNP-MET纳米药物递送系统,探讨ACNP-MET对CD133+人肝癌Huh-7细胞的靶向作用。方法:采用球磨悬浮沉淀法制备ACNP-MET纳米药物递送系统载体ACNP;通过激光粒度分析仪、透射电镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)对其粒径和形态进行表征;用光学显微镜(LM)和TEM观察ACNP对体外细胞形态的影响;采用乳酸脱氢酶(LDH)和组织病理学检查评价ACNP对细胞膜的影响;将一定配比的ACNP与MET超声混悬吸附,观测不同时间点未被吸附的MET的量,以吸附曲线达最高不再上升点所对应的时间作为吸附达平衡时间;将不同配比的ACNP和MET混悬液吸附达平衡后,测未被吸附的MET的量,通过等温吸附公式确定ACNP与MET的最佳配比;采用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133+细胞,并进行干细胞比例分析;通过对CD133+细胞体外成球能力及增殖能力检测,评价CD133+细胞的自我更新能力;观察在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内成瘤情况,评价CD133+细胞的致瘤性;采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)法研究ACNP-MET对体外培养CD133+细胞的生长抑制作用;采用流式细胞术(FCM)测定ACNP-MET对Huh-7细胞中CD133+细胞比例的影响,初步评价ACNP-MET对CD133+细胞的靶向作用;用光学显微镜观察ACNP-MET对CD133+细胞的成球率的影响;应用“微肿瘤”模型评价ACNP-MET对肿瘤干细胞的敏感性。结果:球磨悬浮沉淀法制备的ACNP颗粒大小均匀、形状规则、近似球状、表面光滑,平均粒径为188nm。光镜下观察发现ACNP对细胞有很好的亲和性,细胞生长状态良好;电镜下观察,细胞轮廓明显,核膜完整,核内常染色质均匀分散,核仁大而清晰,与对照组比较未见异常。不同浓度的ACNP作用不同时间,细胞LDH漏出量与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。ACNP腹腔注射后3个月解剖小鼠,腹腔内未见水肿、渗出和粘连等炎症反应;病理组织学检查腹壁及腹膜组织间隙、腹膜淋巴样组织、腹腔淋巴结及淋巴样组织内有大量的ACNP,但其周围组织未见炎症细胞浸润、渗出和水肿;电镜下观察,淋巴细胞的细胞核内有ACNP,但是细胞及亚细胞结构依然正常。ACNP静脉注射后20天及6个月,观察小鼠心、肝、脾、肺和肾组织的病理切片发现,在上述组织中的ACNP周围均未见组织粘连,水肿,渗出等病理现象,脑组织中也未见ACNP。紫外可见分光光度计全波长扫描结果显示,MET在233nm波长处有最大吸收峰,而阴性对照溶液无干扰。故选择233nm为测定波长。在1~10μg/ml范围内,MET的吸光度A与其浓度C呈直线正相关。以吸光度A对浓度C线性回归得标准曲线方程为:A=0.00479+0.08137C(r2=0.9995,P<0.01)。在25℃时,4h左右ACNP吸附MET达到平衡状态,且随着时间的延长吸附量不再发生明显变化;室温条件下,所得等温方程式为C/X=-0.00531+0.00399C(r2=0.995,P<0.01),ACNP对MET的饱和吸附量Xm=256.17mg/g。1g ACNP吸附256.17mg MET达到饱和。故ACNP-MET中MET与ACNP质量比为1:4。利用流式细胞术富集Huh-7细胞中CD133+细胞,分选前的CD133+细胞的百分比为6.08%,分选后再次测试所得细胞中CD133+细胞的百分比为92.81%,统计学分析表明,分选前后有显著差异(P﹤0.05)。CD133+细胞体外无血清培养3d即可成球且生长速度较CD133-细胞快。1×104CD133+细胞在NOD/SCID小鼠体内21d左右即可形成异种移植瘤,测量其体积分别为57.43mm3、57.21mm3、52.51mm3和53.66mm3;光镜下观察小鼠腋下肿块病理组织切片可见,该组织有完整的肿瘤包膜,巨大的肿瘤细胞核,核仁可见,异型性明显,坏死后残存的细胞核碎片呈黑色点状,内部形成坏死区;而1×104CD133-细胞却无一(0/8)成瘤。在体外增殖抑制实验中,含有相同剂量的ACNP-MET组与MET相比,ACNP-MET对CD133+及CD133-细胞均有明显增殖抑制作用,呈剂量依赖性,各组之间的统计学结果P值大都维持在0.001以下。MET及ACNP-MET对CD133-细胞的IC50分别为2.514×104和316.997μg/ml;MET及ACNP-MET对CD133+细胞的IC50分别为64.509和2.847μg/ml,表明二者对CD133+细胞的抑制率明显大于对CD133-细胞的抑制率。ACNP组对CD133+及CD133-细胞的抑制率最大不超过6%左右;与含有相同剂量的ACNP组相比ACNP-MET与MET组对CD133+及CD133-细胞的抑制率具有显著性差异(P<0.01)。通过FCM分析,MET对CD133+肝癌Huh-7有抑制作用,但ACNP-MET对其作用更强,统计学分析具有显著性差异(P<0.01),呈剂量依赖性。在成瘤率实验中,200μg/ml的MET组与空白对照组和ACNP组比较,能减少CD133+细胞所成球数;在50~200μg/ml浓度范围内, ACNP-MET对CD133+细胞体外成球能力的抑制作用呈剂量依赖性,与MET组相比,统计学分析差异具有显著性(P<0.01)。结论:本实验室通过球磨悬浮沉淀法制备出的ACNP与市售的相比,颗粒小且均匀,质量可控,可批量生产;活性炭有良好的生物安全性,纳米化后的ACNP依然具有良好的生物安全性;以CD133为表面标记的流式分选法,可以分选出具有强自我更新能力、增殖能力和致瘤性的肝癌Huh-7干细胞;本研究构建的ACNP-MET,MET与ACNP最佳混合吸附配比为1:4,吸附时间为4h,对MET的最大吸附量为256.17mg/g;MET作为一种用于降低血糖的“老药”可以抑制肝癌干细胞的生长和增殖;含有相同剂量MET的ACNP-MET对CD133+及CD133-肝癌Huh-7细胞的抑制作用均好于MET;ACNP本身没有杀伤CD133+及CD133-细胞的作用,但ACNP可以显著的增强MET对肝癌干细胞的靶向性和抑制性。ACNP与MET构建的药物递送系统对肝癌干细胞具有良好的靶向性,且ACNP-MET无需与其他化疗药连用即可增强MET对肿瘤干细胞的靶向作用。