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目的:肠道菌群存在于宿主肠道之内,可以视为人体正常的器官,其数量之大(1014)、种类之多(300-500种),不容人们对其忽视,这些细菌直接参与宿主的物质代谢,是宿主正常生理活动中不可缺少的重要组成部分。肠球菌虽然不是肠道中数量最多的细菌,但已证实其在肠道中具有一定的生理功能。内源性肠球菌主要定植于回肠和结肠部位,影响宿主肠道的消化吸收及其他功能。现已经从健康人中分离出具有生理功能的肠球菌[1,7],并已在动物体内及人体内证实肠球菌具有降低人及动物胆固醇和甘油三酯水平的作用。目前,市场中已有肠球菌作为调血脂的药品和保健食品上市,所以了解肠球菌在宿主体内的数量以及在服用肠球菌制剂前后宿主体内肠球菌的状况是十分重要的。目前用含叠氮钠成分的培养基定量检测肠球菌是其主要方法。常规的培养计数方法需要1-2天的时间,费时费力[2],且细菌在不良环境中(低温、低养分、HClO等条件下)处于细菌的活的非可培养状态[8](VBNS),使常规的计数方法具有局限性;在提取DNA基础上建立的普通PCR方法只能定性和半定量。近年来,定量PCR方法应用于检测复杂微生物环境中细菌、病毒具有更高的灵敏性和特异性。荧光定量PCR主要分为SYBR GreenI荧光定量PCR和TaqMan荧光定量PCR,各有优缺点。本研究对SYBR GreenI荧光定量PCR和TaqMan荧光定量PCR两种方法检测肠球菌做出了初步探索,目的是建立快速准确定量肠球菌的方法。方法:实验分两部分:第一部分:根据GeneBank发表的肠球菌23SrDNA保守基因序列设计合成了一对引物和探针,利用普通PCR方法从细菌基因组中扩增出目的基因,并连入载体pMD18-T载体中,制成阳性质粒作为灵敏度标准品。对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。将样本处理后,经过DNA提取纯化步骤,定量样本中的肠球菌,并且比较TaqMan荧光定量PCR方法和传统的培养计数方法定量结果的差异。第二部分:根据GeneBank发表的肠球菌23SrDNA保守基因序列设计合成了一对引物,利用普通PCR方法从细菌基因组中扩增出目的基因,并连入载体pMD18-T载体中,制成阳性质粒作为灵敏度标准品。对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了SYBR GreenI荧光定量PCR检测方法。将样本经过处理后,经过DNA提取纯化步骤,定量样本中的肠球菌。并且比较SYBR GreenI荧光定量PCR方法和传统的培养计数方法定量结果的差异。结果:所建立的TaqMan荧光定量PCR方法灵敏度可达6个拷贝数/reaction,所建立的SYBRGreenI荧光定量PCR方法灵敏度也可达7个拷贝数/reaction。粪便样本根据两种实时荧光定量PCR方法所得的理论数值与培养菌值之间无显著性差异(P>0.05)。根据荧光定量PCR方法非炎性腹泻标本中菌数与健康成人标本中菌数无显著性差异(P>0.05)。两种定量PCR方法所得菌数之间无显著性差异(P>0.05)。灵敏度曲线所得的数值大于菌数标准曲线,可能由于DNA提取过程中存在部分的损失。结论:所建立的荧光定量PCR检测方法快速、灵敏、特异,可应用于复杂微生物样本如粪便等中肠球菌的定量检测。