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内质网是真核细胞的重要细胞器,负责新生蛋白质的合成折叠、修饰以及转运等。内质网稳态平衡对于维持正常的细胞功能至关重要。当内质网难以承担错误折叠蛋白的负荷时则引发内质网应激,激活未折叠蛋白反应(UPR,Unfolded Protein Response)信号通路,以此增强内质网的蛋白质加工处理能力。但长期的严重的内质网应激发生时,就会导致细胞发生凋亡。研究发现,内质网应激和神经退行性疾病的发生发展密切相关。GSK3β,一种组成性激活的丝氨酸/苏氨酸激酶,有多种功能,如控制细胞的代谢,细胞周期,基因表达,发育,肿瘤发生和神经保护等。近期研究发现,GSK3β介导内质网应激诱导的细胞凋亡过程,但参与凋亡的一些具体机制还不是很清楚。为研究GSK3β在小脑颗粒神经元细胞(CGNs)内质网应激反应中的作用,本文选取两种诱导内质网应激的化学物质衣霉素(TM,一种N-连接的糖基化的抑制剂)和二硫苏糖醇(DTT)处理CGNs。发现TM的浓度从10μg/ml增加到50μg/ml,细胞的存活率并不随TM的浓度的增加而减少,大概有60%的细胞依然存活,而当DTT的浓度从0.15 mM增加到1 mM时,细胞的存活率由80%下降到30%,说明TM和DTT都能诱导CGNs的凋亡,TM诱导凋亡的过程较为缓慢,相比之下,DTT诱导细胞的快速凋亡。在我们已建立的实验模型基础上检测GSK3β活性变化,发现TM通过增强GSK3β-Ser9的磷酸化而抑制GSK3β活性,而DTT则通过减弱GSK3β-Ser9的磷酸化而增强GSK3β的活性。本文进一步检测GSK3β的上游和下游的一些关键信号分子。已有的研究表明,Akt和JNK是GSK3β上游的重要调节激酶。经检测发现,TM和DTT并不明显影响Akt的活性变化,而TM能瞬时性激活JNK,峰值出现在5分钟左右,DTT则能较长时间激活JNK,持续时间约为6小时。我们推测JNK活性的变化可能跟GSK3β有关,利用SP600125抑制JNK的活性后,发现TM诱导的GSK3β-Ser9磷酸化水平明显降低,但DTT对GSK3β-Ser9磷酸化的抑制没有显著变化,说明JNK可能是TM诱导的内质网应激反应中GSK3β上游的一个调节分子。为研究JNK和GSK3β对细胞存活的影响,本文发现JNK活性的抑制可加剧TM诱导的神经元细胞的凋亡,但显著减弱DTT诱导的细胞凋亡;LiCl抑制GSK3β活性能减弱TM诱导的caspase-3的激活和CHOP蛋白的表达,而对DTT诱导的细胞凋亡无影响,说明JNK可能通过调控GSK3β的活性来调节TM诱导的内质网应激下细胞的存活。最后,我们还检测了能调节JNK活性的蛋白磷酸酶PP2A的表达,结果发现PP2A可能通过调控JNK的活性而参与内质网应激诱导的神经元细胞凋亡。总之,本文研究发现TM处理下能瞬时性激活JNK,JNK可能通过调控GSK3β的活性来影响CGNs的存活,PP2A可能也参与内质网应激诱导的细胞凋亡。