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脑膜瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一,源自脑膜及脑膜间隙的衍生物,约占颅内肿瘤的30%~40%(十年前统计数据为占颅内肿瘤的13%~26%)。根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的分类,脑膜瘤可被区分为WHO I级、WHO II级、WHO III级,其中III级脑膜瘤(恶性脑膜瘤)占总数的5%,比例非常少,但均为恶性脑膜瘤。虽然绝大多数脑膜瘤是良性肿瘤,仅有一小部分脑膜瘤为恶性,但临床研究发现,恶性脑膜瘤常伴有快速生长、侵袭及转移的特性。近年来,脑膜瘤的诊治取得了显著进展,但由于其发病机制尚不明确,复发率仍旧较高。大部分基因转录的产物是非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs),这些ncRNAs根据长度分为短链非编码RNA(Short non-coding RNAs)和长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)。越来越多的报道表明lncRNA在多种肿瘤病理的发生发展过程中具有广泛的生物学作用,影响肿瘤的生长、侵袭、转移和复发。尽管脑膜瘤有了一定的深入研究,但目前仅有极少数的lncRNA被发现同脑膜瘤的发生发展有相关性,仍需要更多的研究探索参与调节脑膜瘤病理发展的lncRNA。lncRNA LINC00460在肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、喉鳞状细胞癌等多种人类肿瘤中均被发现具有致癌性的作用,然而,LINC00460在脑膜瘤中的作用尚不清楚。考虑到lncRNA在其他肿瘤发生发展中的重要作用,我们选择LINC00460作为研究对象,探讨其在脑膜瘤细胞表型中的生物学作用。我们拟通过干扰LINC00460表达,验证LINC00460在脑膜瘤发生中的作用。此外,miR-539也被证实是多种癌症的肿瘤抑制因子,且在脑胶质瘤细胞系和组织中的表达下降,过表达miR-539则可明显抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭。我们通过生物信息学发现LINC00460同miR-539具有结合序列,因此我们拟以miR-539/MMP-9为靶点研究LINC00460的作用机制。目的1.本研究首先分析lncRNA LINC00460在脑膜瘤组织和恶性脑膜瘤细胞株中的表达特点,探讨其是否同脑膜瘤恶性性状相关。2.分析lncRNA LINC00460对脑膜瘤细胞株恶性性状的影响,拟通过缺失实验,探讨lncRNA LINC00460的效应作用。3.以竞争性内源RNA靶向吸附microRNA为理论依据,生物信息学分析lncRNALINC00460靶向miR-539的结合序列,并通过荧光素酶等实验在体外恶性脑膜瘤细胞株上探索二者的表达相关性,揭示lncRNA LINC00460促进脑膜瘤恶性转化的分子机制。方法1.收集33例人脑膜瘤组织及10例正常脑膜组织,其中21例WHOⅠ级脑膜瘤,9例WHOⅡ级脑膜瘤,3例WHOⅢ级脑膜瘤,采用荧光定量PCR方法,比较LINC00460在两种组织中的表达差异。2.采用荧光定量PCR方法,检测良性脑膜瘤细胞株Ben-Men-1和2株恶性脑膜瘤细胞株(IOMM-Lee和CH157-MN)中的LINC00460的相对表达水平,对比三者的表达差异。3.设计3条LINC00460 siRNA duplexes,采用脂质体Lipofectamin 2000转染法将其转染到恶性脑膜瘤细胞株(IOMM-Lee和CH157-MN)中,采用荧光定量PCR方法检测转染48 h后的LINC00460的抑制水平,选择抑制效率最高的一条siRNA。4.采用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee和CH157-MN细胞中,以scramble siRNA转染细胞作为对照,用CCK-8法检测细胞1~5天的增殖水平(每24 h检测一次);用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)法和流式细胞仪检测转染48 h的细胞凋亡水平;用EdU染色并显微镜下计数EdU阳性细胞百分比,评估转染48 h细胞的DNA复制水平。5.采用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee和CH157-MN细胞中,转染24 h后,将细胞种植到Martrigel包被的Transwell小室系统的上室,上室放无血清培养液,下室放含20%胎牛血清的培养液。以scramble siRNA转染细胞作为对照,用结晶紫染色观察24 h的细胞侵袭水平;用荧光定量PCR法和western blot法分别检测侵袭相关分子MMP-2、MMP-9、ZEB1的基因和蛋白表达水平。6.构建IOMM-Lee荷瘤裸鼠,分别在肿瘤内注射2μg的scramble siRNA和LINC00460的siRNA,隔日注射,持续4周,绘制肿瘤生长曲线;用免疫组化方法检测肿瘤中Ki-67的表达水平。7.采用生物信息学软件RNA22 version 2.0预测LINC00460和miR-539,以及miR-539和MMP-9 3’-UTR之间潜在的结合位点,并且构建含突变型或野生型LINC00460的荧光素酶报告基因pGL3载体,同时构建含突变型或野生型MMP-93’-UTR序列的荧光素酶报告基因pGL3载体,将上述pGL3载体同miR-539 mimic或miR NC共转染,用荧光素酶底物检测荧光素酶活性。8.用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee细胞中,荧光定量PCR方法检测转染48 h后miR-539和MMP-9的基因表达;转染miR-539inhibitor或miR NC到IOMM-Lee细胞中,荧光定量PCR方法检测转染48 h后LINC00460和MMP-9的基因表达;进一步的,将LINC00460 siRNA同miR-539 inhibitor共转染,用western blot检测MMP-9的蛋白表达,观察LINC00460 siRNA对miR-539inhibitor的逆转作用。结果:1.同正常脑膜组织相比,人脑膜瘤组织中LINC00460的表达水平明显增高,结果提示LINC00460同脑膜瘤的发生相关。2.为了在体外水平上证实LINC00460同脑膜瘤的发生相关,并且寻找合适的细胞模型进行体外效应和机制研究,我们检测了1株良性脑膜瘤细胞株和2株恶性脑膜瘤细胞株中LINC00460的表达水平。结果显示,同良性脑膜瘤细胞株相比,2株恶性脑膜瘤细胞株中的LINC00460表达水平明显增高,提示LINC00460同脑膜瘤细胞具有体外相关性,并且IOMM-Lee和CH157-MN可作为研究的对象。3.由于LINC00460的升高同脑膜瘤的发生相关,我们拟敲除LINC00460,观察LINC00460在体外水平上,对恶性脑膜瘤细胞株的影响。首先观察了对细胞增殖及其相关因素的影响。通过敲除实验可知,当LINC00460表达被抑制时,IOMM-Lee和CH157-MN细胞的增殖能力受到抑制,第五天时,LINC00460敲除组细胞同非转染细胞之间的增殖差异最为明显(p<0.05)。当LINC00460表达被抑制48 h后,可见IOMM-Lee和CH157-MN细胞中的凋亡细胞均明显增加(p<0.05),IOMM-Lee细胞的凋亡比率从(9.8%±0.8%)上升到(22.5%±2.7%),CH157-MN细胞的凋亡比率从(8.8%±0.7%)上升到(18.2%±2.1%),凋亡的增加有统计学差异;此外,也可发现LINC00460敲除降低了两株恶性脑膜瘤细胞的DNA复制水平,LINC00460敲除可降低IOMM-Lee细胞中51.5%的增殖细胞,降低CH157-MN细胞中67.3%的增殖细胞,增殖细胞数量的减少有统计学差异(p<0.05)。根据这些结果,表明LINC00460表达同恶性脑膜瘤细胞的增殖相关,通过抑制脑膜瘤细胞的DNA复制和上调细胞凋亡可能是LINC00460 siRNA发挥抗增殖作用的原因,对LINC00460的敲除可以降低脑膜瘤细胞株的恶性增殖性状。4.其次,我们设计观察LINC00460同恶性脑膜瘤细胞株的侵袭及其相关因素的关系。通过敲除实验可知,当LINC00460表达被抑制时,IOMM-Lee和CH157-MN细胞的侵袭能力受到抑制,穿透Transwell小室贴附于下壁中的细胞数量明显减少,IOMM-Lee细胞的侵袭数量从(56.4±6.2)降低到(22.1±2.4),CH157-MN细胞的侵袭数量从(46.9±5.3)降低到(17.8±3.2)。同时侵袭相关分子MMP-2、MMP-9、ZEB1的基因和蛋白表达水平均明显下降。这些结果表明LINC00460表达同恶性脑膜瘤细胞的侵袭相关,并且推测可通过MMP-2和MMP-9对细胞外基质和基底膜进行降解,以及调控ZEB1转录因子表达,可能影响上皮间充质转化相关的基因表达。5.此外,我们拟验证LINC00460对体内脑膜瘤的影响,由于IOMM-Lee相对恶性程度较高,因此用LINC00460siRNA抑制IOMM-Lee荷瘤裸鼠瘤内的LINC00460表达,结果显示,LINC00460siRNA可以在28天时间内降低肿瘤的生长能力,同时降低Ki-67的表达水平。表明LINC00460siRNA可以抑制体内脑膜瘤的生长,证实LINC00460影响体内脑膜瘤的生长和细胞增殖。6.生物信息学检测出LINC00460和miR-539,以及miR-539和MMP-9 3’-UTR之间存在结合序列。经对结合位点处序列进行基因突变后,并构建到荧光素酶报告基因载体中,经同miR-539 mimic或miR NC共转染,可见仅野生型LINC00460可同miR-539结合,也发现仅野生型MMP-93’-UTR同miR-539发生直接结合,证实miR-539是串联LINC00460和MMP-9的miRNA。7.在证实miR-539同LINC00460和MMP-9均存在直接结合后,进一步研究miR-539和LINC00460的互作,及其对MMP-9的影响,揭示脑膜瘤中LINC00460/miR-539/MMP-9轴的存在。在脑膜瘤细胞中,当LINC00460表达被抑制时,miR-539和MMP-9也受到影响,miR-539表达上调,而MMP-9表达下降;当miR-539表达被抑制时,LINC00460和MMP-9也受到影响,LINC00460和MMP-9表达均上调;证实LINC00460和miR-539存在互作关系,并且MMP-9是LINC00460/MMP-9互作的下游基因。我们进一步用miR-539 inhibitor抑制miR-539表达,再用LINC00460 siRNA干扰miR-539 inhibitor的作用,可见虽然miR-539 inhibitor通过抑制miR-539表达,进而上调MMP-9蛋白表达,但LINC00460 siRNA逆转了miR-539 inhibitor的作用,证实LINC00460是miR-539的竞争性内源RNA,通过释放miR-539,阻断miR-539 inhibitor对MMP-9 mRNA的调控,这一结果证实脑膜瘤细胞株中确实存在LINC00460/miR-539/MMP-9互作的轴向关系。结论:1.LINC00460在脑膜瘤组织和恶性脑膜瘤细胞株中表达水平均显著上调,证实LINC00460同脑膜瘤恶性性状相关。2.下调LINC00460表达,可以抑制体外脑膜瘤细胞增殖和侵袭能力,降低蛋白MMP-2、MMP-9和ZEB1的表达。3.下调LINC00460的表达,可以抑制裸鼠体内脑膜瘤肿瘤的生长能力。4.LINC00460通过靶向miR-539,下调miR-539,上调miR-539靶基因MMP-9mRNA的表达,从而促进脑膜瘤的增殖和转移。