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目的：青光眼(glaucoma)是一组因病理性眼压升高导致特征性视神经萎缩和视野缺损的疾病。全世界范围内,青光眼最常见的类型为原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)。房水的生成和排出的动态平衡被打破会导致病理性眼压升高,最终导致青光眼。小梁网是最主要的房水流出通道,其中小梁细胞(human trabecular meshwork, HTM)细胞外基质的产生和降解存在着一定的动态平衡,自噬在其中扮演了重要的角色。青光眼是一种年龄相关性疾病,自噬活性随年龄的增加逐步衰退。Atg7基因在自噬活动的早期阶段起着重要的调节作用。我们利用CRISPR/Cas9基因编程技术,通过H202刺激HTM建立青光眼模型,探讨Atg7基因是否在青光眼发病中起到一定作用。睫状体上皮是房水分泌的主要位点,对房水的调节存在昼夜节律。其分泌的melatonin可能是一种重要的调节物质。睫状体上皮细胞的改变可能影响HTM的自噬相关信号通路,因此房水的分泌和流出之间必然存在相互联系。我们选用猪眼睫状体上皮作为实验模型,研究melatonin在房水动力学中的影响,为其作为临床抗青光眼药物提供参考。研究方法：1、利用CRISPR/Cas9系统构建插入了Atg7基因sgRNA的pEP-KO重组质粒,转染HTM后筛选出Atg7基因稳定敲除的HTM-Atg7-/-细胞系,同时得到转染空白质粒的对照组HTM-pEP-KO细胞。2、利用H2O2刺激野生型HTM, HTM-pEP-KO和HTM-Atg7-/-细胞建立氧化应激模型,通过Western Blot在蛋白水平上分析纤连蛋白(fibronectin, FN)和Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ, Col Ⅳ)的改变,并初步检测了可能涉及的信号通路。利用免疫荧光显微镜观察三组细胞在正常及氧化应激状态下自噬指标LC3的变化。3、利用Ussing-type (UT) chamber电生理检测方法测量离体猪眼睫状体上皮的跨膜电位差PD和短路电流Isc。观察不同浓度melatonin以及Cl-通道阻滞剂NFA对睫状体上皮电参数的影响。提取猪眼睫状体上皮NPE/PE细胞,用不同浓度melatonin刺激后通过Elisa检测cAMP的改变。研究结果：1、成功利用CPISPR/Cas9系统得到Atg7基因稳定敲除的HTM-Atg7-/-细胞系,其中LC3-II/LC3-I比例下降,p62蛋白积累增多；没有观察到明显的脱靶效应。2、基础状态时,HTM-Atg7-/-组的Col Ⅳ与FN的表达均比HTM与HTM-pEP-KO组高(p<0.001)。在100μM和300pμM H2O2刺激下,各组的Col IV和FN均比各自的基础水平增高(p<0.05)3、基础状态时,与另外两组相比,HTM-Atg7-/-组的Akt磷酸化(p-Akt)更高,Erk1/2磷酸化(p-Erk)较低(p<0.001,p<0.01),磷酸化p38(p-p38)没有差异；与各自基础状态相比,氧化刺激后各组p-Akt表达无明显变化,p-Erk和p-p38表达明显增加(p<0.001, p<0.05), p-Erk的改变在HTM-Atg7-/-组较另外两组低(p<0.01),而p-p38则高于另外两组(p<0.05)。4、免疫荧光染色发现HTM与HTM-pEP-KO两组细胞LC3染色面积百分比高于HTM-Atg7-/-组(p<0.05); H2O2刺激后无明显改变。5、在NPE侧或NPE与PE侧同时加入melatonin都可以提高猪眼睫状体上皮Isc,幅度分别为45%和53%(p<0.001,p<0.01),两组没有显著差别；NFA可以显著逆转这种改变(p<0.001)。6、10μM和melatonin都可以促进睫状体上皮细胞内cAMP的产生。其中10μM melatonin处理1小时和3小时以及100μM melatonin处理1小时后cAMP的增加有统计学意义(p<0.05)。结论1、利用CRISPR/Cas9建立了Atg7完全敲除的HTM细胞系,细胞的自噬功能受到明显的抑制,但没有完全阻断。没有观察到明显的脱靶效应。2、Atg7基因敲除后HTM细胞外基质分泌增多,可能引起POAG.氧化应激时可能激活p38信号通路导致HTM细胞外基质增多,HTM通过激活Erkl/2信号通路,促使依赖Atg7的自噬活性增强来抵抗外界的氧化刺激。3、Melatonin能够增加猪眼睫状体上皮细胞的cAMP生成,促进C1-分泌进入后房,潜在的增大了房水形成的几率。