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实验背景:结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤疾病,有着较高的发病率和死亡率,其排名仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。研究结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制是抗癌治疗过程中的一项长期任务。在癌症的治疗研究中,人们发现在癌症患者体内一类阳离子小分子化合物-多胺的代谢功能发生紊乱,因此多胺成为治疗性干预中具有强吸引力的靶标。精脒/精胺-N1-乙酰转移酶(Spermidine/Spermine-N1-acetylransferase,SSAT)是多胺代谢途径的第一个限速酶,严格调控着细胞内的多胺水平,因而成为了多胺与肿瘤关系研究中的一个热点。然而,SSAT对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制仍不完全清楚。实验目的:本文以结直肠癌细胞(HCT 116、HT-29)为研究对象,主要研究SSAT对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制。实验方法:首先用蛋白印迹检测法(Western blot)实验方法检测结直肠癌细胞HCT 116和HT-29中SSAT蛋白的表达情况。然后采用细胞转染的方法使细胞内SSAT的蛋白水平上调或者下调。采用高效液相色谱分析法(High Pertormance Liquid Chromatography,HPLC)检测细胞内的多胺水平。接着,通过克隆形成实验和细胞生长曲线分析检测了SSAT蛋白功能的获得或者缺失后对细胞增殖能力的影响。另外,伤口愈合实验以及不铺胶的Transwell小室实验检测了SSAT改变对细胞的迁移能力的影响。铺有基质胶的Transwell小室实验检测了结直肠癌细胞的侵袭能力。利用Western blot检测细胞内AKT、p-AKT、p-GSK-3β、cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin等蛋白的表达。接着,加入外源性多胺后再次检测细胞内多胺的变化,并用Western blot检测外源性多胺多胺是否影响AKT/GSK-3β通路蛋白的变化。除此之外,Transwell小室实验检测了加入GSK-3β抑制剂Li Cl后结直肠癌细胞的侵袭能力变化。并用Western blot检测了GSK-3β抑制受抑制后β-catenin蛋白的变化。实验结果:1、Western blot结果表明SSAT蛋白在结直肠癌细胞HCT 116中的表达水平低于HT-29细胞。高效液相色谱分析法检测结果表明通过细胞转染技术使SSAT高表达的HCT116细胞多胺水平降低,而转染si RNA使SSAT低表达的HT 29细胞内多胺的水平上升。2、克隆形成实验和细胞生长曲线分析结果均表明过表达的SSAT降低了细胞增殖能力,而低表达的SSAT可促进细胞增殖。3、伤口愈合实验显示过表达SSAT细胞表现出迁移抑制作用,而低表达的SSAT则促进了细胞的伤口愈合能力。同样地,Transwell小室实验检测了细胞的垂直迁移能力,并得到了一致的结果。铺基质胶的Transwell小室实验检测了细胞的侵袭能力,表明高表达的SSAT抑制了细胞的侵袭能力,相反地,低表达的SSAT细胞则增强了侵袭的能力。4、Western blot实验表明过表达SSAT的结直肠癌细胞中AKT、p-AKT、p-GSK-3β、cyclin D1、和β-catenin蛋白表达下调,E-cadherin、N-cadherin蛋白水平上调。而低表达的SSAT结直肠癌细胞中蛋白水平变化与之相反。5、外源性多胺的加入使过表达SSAT细胞内多胺含量再次升高。Western blot检测结果表明AKT、p-GSK-3β等蛋白水平出现逆转。6、GSK-3β抑制剂,Li Cl的使用改变了SSAT对HCT 116细胞的侵袭能力的影响,使SSAT抑制的结直肠癌细胞再次获得侵袭能力。Western blot的结果发现β-catenin的蛋白水平随着p-GSK-3β的升高而上调。实验结论:SSAT调控细胞内多胺含量并通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。