背景miRNA(MicroRNA)是一种内源性非编码小RNA,其长度约为18-25个核苷酸。成熟miRNA的5’非翻译区2-7个核苷酸的“种子序列”可以与靶mRNA的3’-非翻译区互补结合,在转录后水平上抑制靶基因的表达。在1993年,发现了第一个micrornalin-4,开始了对microRNA详细研究。随后,许多实验室发现了至少500种真核生物的小分子RNA,其分别在线虫、鼠、果蝇、拟南芥和人类中,约有300多种染色体存在于人类中,占人类基因的1-4%。miRNA的编码基因在所有调控基因中是最大的。miRNA的编码基因在细胞生长、发育和凋亡中扮演着重要作用,与多种肿瘤的发生和发展关系密切。MiRNA在各种肿瘤中发挥重要作用,类似癌基因或抑癌基功能,调控着癌细胞的多种生物学行为。我国是食管癌发生率较高的国家,食管癌是比较常见的恶性肿瘤之一,每年食管癌死亡患者约有15万人,大概占恶性肿瘤患者的总死亡人数的1/4。虽然关于食管癌的发病原因,目前研究已取得很大成果,但是目前么有完全探明。手术是治疗食管癌的首选治疗手段,但是食管癌起病五明显症状,临床缺乏特异性的症状,所以大部分食管癌病人入院时,已进展为晚期,丧失了最好的手术时机。即使是早期食管癌,对很多患者来说,仍然是致命性的,食管癌患者可以切除的5年总生存率仅约24%。放疗和化疗可以有效提高食管癌患者的局部控制率,远期生存率可以改善,目前是治疗食管癌重要的辅助方法。手术、放疗、化疗结合的综合治疗,目前在食管癌治疗中广泛地运用。但是放化疗伴随着严重的毒副反应,虽然杀灭肿瘤细胞,但是也会损伤机体正常细胞,同时食管癌患者远期生存率也不高。复发和转移是食管癌患者预后较差的主要原因,如何寻找更为有效的治疗办法和治疗基因靶点,抑制癌症局部复发和远处转移目前是是临床急需要解决的重点及难点问题。目前研究发现食管癌中很多miRNAs异常表达,在食管癌的形成过程中扮演着非常重要的角色。例如,在食管癌中,发现miR-122是一个异性miRNA,在食管正常功能中发挥平衡调节作用。和正常食管组织比较,miR-122在食管癌组织中的表达明显下调;而miR-221/222含量在食管癌细胞中却明显上升,miR-221/222可以抑制其靶基因而发挥作用,研究证实-基因CDKN1B/p27和CDKN1C/p57为其抑癌基因。越来越多的miRNA,在不断研究中,被证明其在食管癌的发生进展中扮演了重要角色,如何鉴定这些miRNA,了解其多个靶基因和分子机制具有重要意义。人们希望早日明确癌症的发病机制,找到肿瘤诊治靶标,发明新的癌症的分子诊断方法和治疗措施。本研究参考了国内外相关文献,根据食管癌miRNA表达谱的结果,同时结合分析生物信息学,我们确定了miR-125b作为研究重点。目的首先在食管癌及食管癌细胞系中,明确了miR-125b的表达水平,然后进一步明确miR-125b的生物学意义,最后分析miR-125b的甲基化同其表达缺失有何关系,根据结果,探索在肿瘤发生和发展中可能存在哪些分子作用。方法1.在食管癌和食管癌细胞系中检测miR-125b的表达水平。实验材料包括:94例食管癌肿瘤及瘤旁组织标本;一株人食管正常上皮细胞系:6株食管癌细胞系。通过提取RNA,然后反转录获得cDNA,利用PCR相关技术,测定miR-125b的表达水平。2.建立真核表达载体miR-125b,使用慢病毒包装方法,得到过表达miR-125b的毒液。使用此毒液攻击食管癌细胞,采用流式细胞分选方法,进而得到高纯度过表达的miR-125b食管癌细胞株。3.miR-125b过表达以后,我们使用MTT、克隆传代、裸鼠成瘤实验、流式细胞术等实验方法,检测其对细胞增殖以及凋亡的相关影响。4.运用特异性PCR技术测定食管癌miR-125b甲基化,探讨其mi R-125b的甲基化状态,寻找miR-125b表达和甲基化之间可能的关系。结果1.通过实验,对94例食管癌及其癌旁组织、一株正常食管上皮细胞和6株食管癌细胞系的miR-125b的表达水平进行了检测,其中45例食管癌组织(45/94)miR-125b表达降低,3株食管癌细胞系(3/6)的miR-125b表达也降低。2.miR-125b真核表达载体(pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP)被顺利构建,通过基因转染,过表达miR-125b的食管癌细胞株被获得。通过MTT方法及克隆传代实验和裸鼠皮下实验,miR-125b可以抑制食管癌细胞的体内和体外增殖能力被证实;对于正常培养的食管癌细胞,采用流式细胞术和Hoechst33342细胞染色的方法,证实了miR-125b可以促进其凋亡。3.miR-125b在人食管癌中发生甲基化,其部位为基因启动子区域,在食管的轻、中、重度不典型增生组织里,这种甲基化改变也同时发生。这为食管癌的早期辅助诊断提供了可能。甲基化的调控改变了miR-125b在食管癌中的表达,这一发现提示,采用miR-125b的去甲基化方法,将为食管癌的分子靶向治疗提供新的治疗思路。结论通过研究,发现在食管癌组织中及食管癌细胞系中,miR-125b的表达降低,过表达miR-125b食管癌细胞,可以促进肿瘤细胞凋亡。过表达mi R-125b可以抑制肿瘤细胞增殖和裸鼠成瘤的能力,证实miR-125b表达缺失的主要原因是mi R-125b甲基化。通过以上研究结果,可以使食管癌的发生、发展机制研究更加深入,为以后的临床治疗奠定了实验基础。