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淫羊藿属植物作为传统道地性药材使用已有2000多年的历史;同时,因其花色、叶色丰富多彩已成为新型观赏植物。淫羊藿植物药效成分主要由丰富的类黄酮类物质构成。为此,以往研究多集中于类黄酮成分有效提取;而涉及到有关淫羊藿类黄酮代谢分子机制的研究鲜有报道甚至空白。此外,关于淫羊藿属种间尤其是中国种的分子分类和系统进化关系依然模糊不清。值得注意的是:由于其巨大的商业价值导致过渡采收,使得淫羊藿野生资源遭到严重破坏甚至濒临灭绝。因此,当务之急是采用分子手段深入开展淫羊藿类黄酮代谢分子机制研究和对现有多样性资源评估和保护是以利于今后可持续利用淫羊藿资源。在淫羊藿经典遗传学和分子生物学研究基础薄弱的情况下,本研究采用454新型测序技术测序箭叶淫羊藿盛花期叶片转录组、MISA软件开发挖掘EST-SSR分子标记、构建类黄酮差异表达SSH文库、同源克隆结合RACE技术克隆全长基因等方法从不同层面着手,试图为解析淫羊藿类黄酮代谢分子机制寻找突破口;同时,也期望为淫羊藿属植物的分子分类、系统生物学、保护生物学和分子育种工作提供信息支撑。本研究的主要内容和结论如下: 1.采用454 GS-FLX测序方法,序列拼接后获得76,459条consensus序列,其中包括17,231条contig序列和59,228条singlet序列。另外,其中29,466条序列(38.5%)在NR数据库中能够找到与之匹配的homolog(E<1e-10);22,295条consensus序列被GO成功注释。序列比对和系统发育分析表明:EsERF转录因子家族分化发生在单双子叶植物分化之前、被子植物和裸子植物分化之后;而且近期EsERF基因发生了一次基因复制事件。同样,EsbZIP基因也发生了一次基因复制事件。EsWRKY转录因子家族分化发生在单双子叶分化之前、裸子植物和Amborella分化之后;淫羊藿可能发生了染色体复制、片段化复制和串联复制事件,至少是基因复制事件;这些复制事件的发生或多或少导致巨大的淫羊藿基因组。 2.采用MISA软件开发挖掘了2,810个EST-SSR位点。其中,丰度最高的是三碱基SSR达到55.2%,紧随其后的是二碱基SSR(30.4%)、四碱基SSR(7.3%)、六碱基SSR(4.9%)和五碱基SSR(2.2%)。丰度最高的重复基序是AAG/CTT达到23.6%,位列其后的依次是AG/CT(19.3%)、ACC/GGT(11.1%)、AT/AT(7.5%)和AAC/GTT(5.9%)。与其他碱基重复相比,三碱基SSR更倾向于分布在蛋白编码区域;EST-SSR倾向于分布在UTRs而非蛋白编码区域。随机合成32对引物检测EST-SSR跨种转移率,其中21对引物(转移率高达85.7%)成功扩增,另外11对引物没有扩增带或扩增出非目的条带。 3.构建SSH文库结合反向Northern技术成功筛选到了与类黄酮代谢途径相关各个层面的基因如结构基因(CHS、FLS和UFGT等)、调控基因(WD和MADS等)和运输转运子(GST和ABC transporter等)等有价值的信息。利用RACE技术获得了EsMADS全长基因,序列分析和系统发育树结果表明:与已知参与类黄酮调控的SQUA亚家族IbMADS10和Bs亚家族TT16不同,EsMADS属于STMADS11亚家族。表达谱分析结果表明:EsMADS与淫羊藿类黄酮代谢途径结构基因表达模式一致,EsMADS很可能是一个新的调控类黄酮代谢的MADS基因。 4.通过同源克隆结合RACE技术,成功克隆了EsCHS2、EsCHS3、EsCHI1、EsCHI2、 EsDFR1和EsDFR2全长基因;EsCHS1的3末端完整基因。系统发育研究发现:(1)EsCHS基因发生了基因复制事件;(2)EsCHI2是Ⅰ型和Ⅱ型CHI分化之前的祖先基因的homolog;这暗示着EsCHI2可能具有豆科植物特有的Ⅱ型CHI基因的功能;(3) EsDFR1和EsDFR2分别属于Asp型DFR和Asn型DFR,在系统发育树上EsDFR1和EsDFR2与单子叶植物DFR基因构成一个独立的分支,与其植物分类的系统关系不吻合。此外,在类黄酮代谢途径中下游基因DFR的进化速率大于上游基因CHS和CHI。