目的:细胞分裂周期蛋白磷酸酶14(cell division cycle protein phosphatase14,Cdc14)属于高度保守的丝、苏氨酸双特异性磷酸酶家族,能够下调CDK(Cyclin dependant kinase,周期素依赖性激酶)的活性,是重要的细胞周期调节蛋白,在真核生物细胞中广泛表达。Cdc25B(细胞分裂周期同源25B)是一种双重磷酸酶,可使Cdc2(Cdk1))的Thr14和Tyr15脱磷酸从而激活cyclinBl-cdc2复合体(MPF),导致G2/M期转变。非洲裂殖酵母研究表明:Cdc14能与Cdc25结合,使Cdc25脱磷酸而变的不稳定随后降解,因此过表达的Cdc14使Cdc25脱磷酸化,细胞阻滞于G2期;哺乳动物基因编码两个Cdc14亚型:Cdc14A和Cdc14B。对人的细胞研究表明:人的Cdc14A磷酸酶通过控制Cdc25B的活性来调节细胞G2/M过渡,过表达Cdc14A使Cdc25B脱磷酸化,抑制Cdc2激酶的活性从而使细胞阻滞于G2期。我们前期对小鼠一细胞期受精卵的研究已经证实了Cdc25B在G1期和S期是磷酸化的,在G2和M期是脱磷酸化的。但是在小鼠一细胞期受精卵中Cdc14A对Cdc25B是否具有调控作用以及通过什么方式进行调控、过表达Cdc14A(WT,野生型有活性和C278S,突变型无活性),能否使小鼠一细胞期受精卵阻滞于G2期,尚不清楚。本研究以小鼠一细胞期受精卵作为研究对象,通过显微单注射Cdc25B-WT、Cdc25B-S15A、Cdc25B-S186A、Cdc25B-S15D、Cdc14A-WT、Cdc14A-C278S的mRNA观察一细胞期受精卵的卵裂率、死亡率及G2/M转变的影响;通过显微共注射Cdc25B-WT、Cdc25B-S15A、Cdc25B-S186A、Cdc25B-S15D和Cdc14A-WT的mRNA来观察一细胞期受精卵的卵裂率、死亡率及G2/M转变的影响,从而探讨Cdc14A与Cdc25B对小鼠一细胞期受精卵G2/M转变的影响。方法:1.小鼠超排卵以及收集G1、S、G2、M四个时相的小鼠一细胞期受精卵;2.构建pcDNA3.1-MYC-Cdc14A(C278S)、pcDNA3.1-MYC-Cdc14A-WT、pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)、pcDNA3.1-3xflagCdc25B(S15D)、pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S186A)真核表达载体;3.将构建的表达质粒体外转录成mRNA,用于显微注射;4.mRNA的显微注射,观察对受精卵发育的影响;5.Western Blotting检测Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;6.放射免疫测定MPF的活性;结果:1.Cdc14A-C278S-mRNA、Cdc25B-S15A-mRNA单独注射组与对照组相比,开始卵裂时间、MPF活性变化及Cdc2-Tyr15的磷酸化信号均无差异;2.Cdc25B-WT-mRNA、Cdc25B-S15D-mRNA、Cdc25B-S186A-mRNA三个单独注射组的开始卵裂时间、MPF活性变化及Cdc2-Tyr15的磷酸化信号均无差异;3.Cdc14A-WT-mRNA单独注射组和Cdc14A-WT-mRNA+Cdc25B-S15A-mRNA共注射组与对照组相比,开始卵裂时间延迟,卵裂率降低,MPF活性达到峰值时间和检测到Cdc2-Tyr15的磷酸化信号的时间均延迟;4.Cdc14A-WT-mRNA+Cdc25B-WT-mRNA共注射组和Cdc14A-WT-mRNA+Cdc25B-S186A-mRNA共注射组的开始卵裂时间、MPF活性变化及Cdc2-Tyr15的磷酸化信号均无差异;5.Cdc14A-WT-mRNA+Cdc25B-S15D-mRNA共注射组与对照组相比,开始卵裂时间提前,卵裂率升高,MPF活性达到峰值时间和检测到Cdc2-Tyr15的磷酸化信号的时间均提前。结论:1.过表达Cdc14A-WT,小鼠一细胞期受精卵延迟进入M期;Cdc14A-C278S对小鼠一细胞期受精卵G2/M期过渡没有影响。2.Cdc25B-S186A、Cdc25B-S15D与Cdc25B-WT具有相同或相似的活性,能使小鼠一细胞期受精卵卵裂提前,加速G2/M期的转换;由于Cdc25B-S15A的第15位丝氨酸突变成丙氨酸而不能磷酸化而失活,对小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换没有影响。3.小鼠一细胞期受精卵中Cdc14A和Cdc25B可能存在相互作用,相互作用的具体位点可能是Cdc25B-S15,而不是Cdc25B-S186。4.Cdc14A能使Cdc25B的第15位丝氨酸脱磷酸化而失活,小鼠一细胞期受精卵阻滞于G2/M期。因此认为Cdc14A是细胞周期的一个负性调节因子。