目的：动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的病理本质是慢性炎症反应。SM22α是分子量为22kD的细胞骨架相关蛋白，是平滑肌细胞分化早期的标志物之一，其表达降低也是衡量平滑肌细胞去分化的一个重要标准。我室以往研究表明，SM22α参与调节平滑肌细胞表型转化、增殖和氧化应激，有研究显示，SM22α缺失可增加血管平滑肌细胞ROS生成促进NF-κB活化，加剧血管炎症反应。本研究试图揭示其中的分子机制。方法：利用Sm22α-/-小鼠建立颈总动脉损伤模型，评价SM22α与血管炎症损伤的关系；收集人动脉粥样硬化标本进行验证。利用报告基因、染色质免疫共沉淀分析等技术，从表观遗传学层面，确定炎症刺激下，SM22α表达下调与组蛋白甲基化的动态关系及其上游信号途径；利用蛋白免疫印迹、免疫共沉淀、免疫沉淀和免疫荧光共定位分析等技术，从蛋白质互作、蛋白质修饰的角度探讨SM22α对NF-B经典信号途径IKKβ-I Bα-NF-B活化的影响及其分子机制。结果：1SM22α缺失加剧血管炎症1.1血管转录组学分析显示SM22α缺失激活NF-κB利用生物信息学方法对Sm22α-/-小鼠和同窝的Sm22α+/+小鼠主动脉组织转录组测序数据进行挖掘。结果显示，在Sm22α-/-小鼠的主动脉组织中有大量炎性因子、促炎因子的表达上调；通过IPA软件分析，发现数据基因表达模式的变化是由上游调控因子——核转录因子（nuclear factor κB,NF-κB）所调控。1.2SM22α缺失加剧损伤诱导的血管炎性反应将Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠行颈总动脉结扎内皮损伤模型，取颈总动脉切片，HE染色结果显示：颈总动脉结扎14天后，两组小鼠均有新生内膜形成，内膜弥散性增厚，管腔狭窄，中膜平滑肌细胞排列紊乱。Sm22α-/-小鼠新生内膜增生的程度明显大于Sm22α+/+小鼠。免疫组织化学分析结果显示：与Sm22α+/+小鼠相比，Sm22α-/-小鼠损伤的颈总动脉中，炎性因子MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMP-2和MMP-9的阳性着色细胞数明显增多。提示，SM22α缺失加剧损伤诱导的血管炎性反应。1.3临床病理验证SM22α与血管炎性反应的相关性收集人正常和动脉粥样硬化斑块组织，免疫组织化学分析结果显示，动脉粥样硬化斑块中SM22α蛋白的阳性着色（棕色或棕黄色）细胞数目明显减少，而炎性因子MCP-1、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、MMP-9阳性着色（棕色或棕黄色）细胞数目明显增多。2TNF-α抑制SM22α表达的表观遗传学机制2.1TNF-α诱导SM22α基因表达下调TNF-α（10ng/ml）刺激细胞12小时，提取总RNA用荧光实时定量PCR的方法检测SM22α的表达。结果显示，TNF-α可显著抑制SM22α基因的转录。同时，用Western Blot检测SM22α蛋白水平的变化。结果显示，TNF-α刺激细胞24小时后，SM22α蛋白水平显著下调。此外，SM22α报告基因分析结果显示，TNF-α抑制SM22α基因启动子转录活性。2.2TNF-α诱导SM22α基因启动子区H3K27的甲基化利用ChIP-qPCR技术检测SM22α启动子区H3K9me3和H3K27me3的富集状况。结果显示，TNF-α刺激后，SM22α基因启动子特定区域出现H3K27me3的显著富集，而H3K9me3没有明显变化。同时，转录因子SRF在启动子区的募集显著减少。上述结果表明，组蛋白H3K27三甲基化修饰参与TNF-α诱导的SM22α转录抑制。2.3甲基转移酶EZH2介导H3K27甲基化和SM22α基因沉默Western Blot结果显示，与单纯给予TNF-α刺激组相比，过表达EZH2，再给予TNF-α刺激后，总H3K27me3水平显著升高。CHIP-qPCR结果显示，与TNF-α刺激组相比，过表达EZH2，再给予TNF-α刺激，SM22α组蛋白H3K27me3的富集显著增加，而转录因子SRF在SM22α启动子区的募集显著减少。与此一致的是，SM22α报告基因分析结果表明，过表达EZH2后，TNF-α显著抑制SM22α基因启动子活性。上述结果表明，EZH2参与SM22α基因组蛋白H3K27三甲基化和SM22α基因的转录抑制。2.4激活SIRT1可以解除TNF-α诱导的EZH2乙酰化活化为了探讨TNF-α诱导EZH2甲基转移酶活性升高的机制，本研究对EZH2的乙酰化修饰进行分析。结果显示，TNF-α可诱导EZH2发生乙酰化修饰。SRT1720可以显著降低TNF-α诱导的EZH2乙酰化修饰水平，表明EZH2是SIRT1的底物之一。CHIP-qPCR结果显示，给予SRT1720后TNF-α诱导的H3K27me3在SM22α启动子特异区域的富集显著减少，而转录因子SRF在SM22α启动子区的富集显著增加。SM22α启动子报告基因分析结果显示，SRT1720可以逆转TNF-α对SM22α基因启动子活性的抑制。上述结果表明，SIRT1介导的EZH2去乙酰化失活可降低H3K27me3水平，进而逆转组蛋白甲基化导致的SM22α基因沉默。SIRT1激活的最终结果是上调SM22α基因表达。2.5Sirt1-Tg/Sm22α-/-小鼠损伤诱导的血管炎症增强利用Sirt1转基因小鼠（Sirt1-Tg）与SM22α敲除小鼠（Sm22α-/-）杂交制备Sirt1-Tg/Sm22α-/-小鼠，行颈总动脉结扎术，观察颈总动脉损伤后炎症反应。免疫组织化学染色结果显示，与Sirt1-Tg/Sm22α+/+相比较，Sirt1-Tg/Sm22α-/-小鼠动脉壁的炎性标志物MCP-1、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、MMP-9的阳性着色（棕色或棕黄色）细胞数明显增多，密度扫描分析表明，这些炎性因子的表达水平明显高于Sirt1-Tg/Sm22α+/+。2.6CKII促进SIRT1活化及其与EZH2的相互作用免疫沉淀结果显示，过表达SM22α不改变SIRT1的总蛋白水平，但是SIRT1磷酸化水平显著升高；反之，敲低SM22α后，SIRT1的磷酸化水平显著降低。SIRT1与EZH2相互作用减少，伴随SIRT1磷酸化水平的降低。用CKII抑制剂Heparin或CKII小干扰RNA敲低内源性CKII表达可以显著抑制SIRT1的磷酸化。提示CKII是介导SIRT1磷酸化的主要激酶。无论是敲低CKII还是给予Heparin都可以显著抑制SIRT1与EZH2的相互作用。结果表明，CKII是SIRT1介导EZH2失活的上游激酶。交互免疫共沉淀结果显示，敲低SM22α后，促进CKII和SIRT1二者的解离。2.7SM22α是CKII与SIRT1相互作用的分子平台免疫共沉淀结果和免疫双荧光共定位结果均显示，SM22α、CKII和SIRT1三者相互结合、共定位。SM22α作为CKII和SIRT1的支架参与调节SIRT1的磷酸化修饰。3SM22α抑制NF-κB激活的分子机制3.1SM22α抑制NF-κB的核转位活化及下游炎性基因表达3.1.1SM22α抑制NF-κB下游炎性基因表达利用腺病毒Ad-SM22α感染血管平滑肌细胞，再用TNF-α刺激细胞，提取总RNA用荧光实时定量PCR的方法检测NF-κB下游炎性基因的表达。结果显示，过表达SM22α，显著降低TNF-α诱导的ICAM-1、VCAM-1和iNOS基因的转录水平。Western Blot显示相似结果。结果表明，SM22α抑制NF-κB下游炎性基因的表达。3.1.2SM22α抑制NF-κB的核转位利用腺病毒Ad-SM22α感染血管平滑肌细胞，再给予TNF-α刺激。用Western Blot检测NF-κB p65核转位的动态变化，结果显示，TNF-α刺激细胞30分钟时NF-κB p65核转位最明显，过表达SM22α后能够显著抑制TNF-α诱导的NF-κB p65核转位。反之，用SM22α小干扰RNA敲低内源性SM22α表达，TNF-α诱导的NF-κB p65核转位作用显著增强。同样，在Sm22α-/-小鼠的血管平滑肌细胞中，TNF-α诱导的NF-κB p65核转位显著增加。3.1.3SM22α抑制NF-κB DNA的结合及转录激活活性寡核苷酸沉淀检测NF-κB DNA结合活性。结果显示，TNF-α刺激后，NF-κB DNA结合活性增强，而Ad-SM22α加TNF-α刺激组NF-κB DNA结合活性显著减弱。此外，含有6个增强子κB重复序列串联6×κB-Luc报告基因活性分析显示，共表达pEGFP-SM22α的HEK293细胞，给予TNF-α刺激6小时后，荧光素酶报告基因活性明显降低。3.2SM22α通过与IκBα相互作用阻止其磷酸化降解3.2.1SM22α抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化降解为了探讨SM22α抑制NF-κB核转位的作用靶点，将腺病毒Ad-SM22α感染细胞后，给予TNF-α短时间点刺激。Western Blot结果显示，过表达SM22α明显抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化降解，但不影响IKK磷酸化水平。反之，敲低SM22α后，TNF-α诱导的IκBα的磷酸化水平明显升高，降解明显加快。此外，在Sm22α-/-小鼠的血管平滑肌细胞中也证实了这一点。上述结果提示，IκBα是SM22α抑制NF-κB活化的上游作用靶点。3.2.2SM22α与IκBα互作的动态变化免疫共沉淀结果显示，在静息状态下，SM22α与IκBα结合共定位，TNF-α刺激15分钟后，SM22α与IκBα二者解离。在HEK293细胞中转染质粒pEGFP-SM22α，或用腺病毒Ad-SM22α感染Sm22α-/-小鼠血管平滑肌细胞，补救SM22α表达，交互免疫共沉淀检测SM22α与IκBα相互作用，TNF-α刺激导致二者相互作用减弱。3.3CKII介导的SM22α磷酸化促使IκBα解离3.3.1炎性刺激下，CKII介导SM22α Thr139磷酸化免疫沉淀结果显示，TNF-α刺激15分钟，SM22α磷酸化水平达到峰值。基于SM22α分子中存在两个潜在的CKII磷酸化位点：Ser16和Thr139，分别利用CKII激酶的抑制剂Heparin、CKII负显性失活突变体和小干扰RNA siCKII抑制CKII活化。免疫沉淀结果显示，CKII的失活能有效削弱TNF-α诱导的SM22α苏氨酸磷酸化。此外，CKII的恢复实验也充分证实CKII是TNF-α诱导SM22α苏氨酸磷酸化的激酶。为了验证SM22α T139是CKII作用的活性位点，进而构建SM22α T139突变体—SM22α T139A（非磷酸化突变体）和SM22α T139D（持续磷酸化突变体）。利用Sm22α-/-小鼠的血管平滑肌细胞，过表达SM22α WT或SM22αT139A或SM22α T139D后，再分别给予TNF-α刺激。结果显示，补救表达的野生型SM22α可被诱导发生磷酸化；导入SM22α T139A，SM22αT139D两组都检测不到磷酸化的SM22α。结果表明，TNF-α通过激活CKII进而诱导SM22α T139磷酸化。3.3.2磷酸化的SM22α与IκBα解离分别将野生型SM22α和磷酸化位点突变体SM22α T139D、SM22αT139A转入Sm22α-/-小鼠的血管平滑肌细胞。交互免疫共沉淀结果显示，IκBα与SM22α T139A的亲和力明显高于SM22α T139D。此外，Westernblot结果显示，过表达SM22α T139A能明显抑制TNF-α诱导的IκBα的磷酸化降解和NF-κB核转位，而过表达SM22α T139D明显增加IκBα的磷酸化降解和NF-κB核转位。上述结果表明，TNF-α诱导SM22α T139磷酸化，导致SM22α释放出IκBα，使IκBα暴露出磷酸化位点，继而发生磷酸化降解，触发NF-κB的核转位。结论：1SM22α缺失加剧血管炎症；2EZH2介导的H3K27三甲基化修饰导致SM22α基因的沉默；SIRT1通过使EZH2脱乙酰化而表观遗传学激活SM22α基因表达；3SM22α通过稳定IκBα抑制TNF-α诱导的NF-κB活化，TNF-α通过激活CKII进而诱导SM22α磷酸化，解除其对NF-κB的抑制作用。