宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤,发病率居女性恶性肿瘤的第二位,严重威胁着妇女的生命健康,近年来发病人群更趋于年轻化。人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）感染已明确为宫颈癌的重要致病原因,但是大多数HPV阳性的妇女并不发展为宫颈癌,故认为尚有其它因素参与了宫颈癌的发生。目前,宫颈癌的治疗以手术为主,但由于恶性肿瘤具有侵袭性生长的特性,手术常无法完全切除,即使辅助以放、化疗,宫颈癌的复发率、死亡率仍然很高。因此,如何对晚期宫颈癌患者采取最有效的治疗仍是妇科肿瘤医生所面对的一大难题,而解决问题的关键在于明确其分子发生机制。现代肿瘤学观点认为,肿瘤的发生是一个多因素、多步骤及多阶段的复杂过程,不仅与遗传改变有关,表观遗传异常也是肿瘤发生、发展的原动力之一。表观遗传是指不改变DNA序列,而是通过对核苷酸或染色体的可逆性修饰以调节基因的表达,这种修饰又是可遗传的。它常通过DNA的甲基化、RNA相关沉默和组蛋白修饰3种方式调控基因的表达。研究表明,DNA甲基化在肿瘤的发生、发展过程中扮演着关键性的角色。DNA甲基化指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransrase,DNMT）的作用下,以S-腺苷.L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）为甲基供体,将甲基转移到胞嘧啶的5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5^mC）的过程。DNA甲基化异常,主要表现为局部区域关键基因的异常高甲基化和全基因组的广泛低甲基化。基因启动子区的CpG岛在正常状态下一般是非甲基化的,基因能正常表达,当其发生甲基化时,影响基因转录调控,常导致基因表达发生沉默,使重要基因如抑癌基因、DNA修复基因等功能丧失,从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复,在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。目前,在真核生物中发现了5类DNMTs,即DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。其中DNMT1发挥着极为重要的作用。DMNT1催化的甲基化修饰在调控细胞正常生长中起重要作用,参与DNA复制修复、调控胚胎发育、女性X染色体基因灭活、基因组印记和抑制外源寄生序列表达等。DNMT1在正常组织中普遍呈低表达,而在多种实体肿瘤和造血系统肿瘤中高表达,并伴有酶活性的升高。因此,DNMT1与肿瘤密切相关,有望成为肿瘤治疗的一个重要靶点,抑制DNMT1活性已成为从逆转异常甲基化角度治疗肿瘤的重要手段。死亡相关蛋白激酶（death-associated potein kinase,DAPK）是一种钙离子/钙调素依赖激酶,可使其底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,具有促细胞凋亡活性,在各种不同刺激下担任凋亡正向调节者的作用。由于DAPK在细胞凋亡、肿瘤抑制方面的重要作用,故被认为是抑癌基因。近年来,DAPK基因启动子区CpG岛甲基化与肿瘤的关系备受关注。目前,已在多种肿瘤组织中发现DAPK基因启动子高频率甲基化,提示DAPK启动子甲基化与肿瘤的发生发展有着密切的联系。由于DNA甲基化具有可逆转性,因此,有可能通过逆转DAPK基因甲基化来治疗肿瘤,DAPK基因在肿瘤治疗中有望作为一种潜在的药物作用靶点。本研究通过检测宫颈癌组织中DNMT1 mRNA的表达及宫颈癌HeLa细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达情况,分析宫颈癌组织中DNMT1的表达与其临床病理因素的关系;通过检测宫颈癌组织中DAPK基因启动子甲基化及其蛋白表达的情况和宫颈癌HeLa细胞中DAPK基因启动子甲基化状况,分析DAPK启动子甲基化与其基因失活的关系及DNMT1表达与DAPK甲基化的相关性;利用构建重组干扰质粒pshRNA-DNMT1进行转染宫颈癌HeLa细胞,观察转染后其对HeLa细胞中DNMT1基因的抑制效果,及对细胞增殖和凋亡的影响。通过以上实验,以期进一步了解宫颈癌的发生机制,寻找宫颈癌治疗的潜在分子靶点,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据。本实验分为以下三部分。第一部分DNMT1在宫颈癌中的表达及其意义的研究方法1.应用原位杂交方法检测正常宫颈组织20例、宫颈上皮内瘤变组织（cervicalintraepithelial neoplasia,CIN）60例及宫颈癌组织52例中DNMT1 mRNA的表达情况,分析DNMT1 mRNA的表达与宫颈癌临床病理因素的关系。2.采用RT-PCR方法检测子宫颈癌HeLa细胞中DNMT1 mRNA,了解HeLa细胞中有无DNMT1 mRNA的表达。3.采用Western blotting检测宫颈癌HeLa细胞中DNMT1蛋白的表达。4.统计学处理:实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计数资料的阳性率采用χ²检验,以α=0.05为显著性检验标准。结果1.DNMT1 mRNA在正常宫颈、CIN和宫颈癌组织中的阳性率分别为10.0%、63.3%、78.8%,差异有统计学意义（χ²=29.057,P=0.000）。其中正常宫颈组织和CIN中DNMT1 mRNA差异有统计学意义（χ²=17.067,P=0.000）,CIN和宫颈癌组织差异无统计学意义（χ²=3.226,P=0.072）。2.DNMT1 mRNA在宫颈癌组织中的表达与病理类型、组织学分级、临床分期及有无淋巴结转移无关（分别为χ²=0.601,P=0.438;χ²=2.160,P=0.340;χ²=1.387,P=0.239;χ²=0.578,P=0.447）。3.宫颈癌HeLa细胞中存在DNMT1 mRNA及蛋白表达。第二部分DAPK甲基化和宫颈癌的关系及其与DNMT1表达的相关性研究方法1.采用甲基化特异性聚合酶链式反应（methylation-special pomerase chainreaction,MSP）检测宫颈癌、CIN、正常宫颈组织和宫颈癌HeLa细胞中DAPK基因启动子甲基化状况,并将其与宫颈癌的临床病理资料进行分析。2.免疫组化法检测宫颈癌、CIN和正常宫颈组织中DAPK蛋白表达情况,分析DAPK蛋白的表达与宫颈癌临床病理因素的关系。3.分析DAPK甲基化与其蛋白表达的关系及DNMT1表达与DAPK甲基化的相关性和意义。4.统计学处理:采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。阳性率比较采用χ²检验,两者之间的关系采用Spearman等级相关分析。以α=0.05为显著性检验标准。结果1.宫颈癌组织中DAPK蛋白阳性表达率（40.4%,21/52）显著低于CIN（75.0%,45/60）和正常宫颈组织（100.0%,20/20）。正常宫颈组织与CIN及CIN与宫颈癌组织相比较,DAPK蛋白阳性表达率差异均有统计学意义（分别为χ²=4.622,P=0.032;χ²=13.791,P=0.000）。2.Ⅲ-Ⅳ期宫颈癌组织中DAPK蛋白阳性表达率（14.3%,2/14）低于Ⅰ-Ⅱ期（50.0%,19/38）,差异有统计学意义（χ²=4.038,P=0.044）;但其阳性率与宫颈癌的病理类型、组织学分级和淋巴结转移无关（分别为χ²=1.231,P=0.267;χ²=0.289,P=0.866;χ²=1.838,P=0.175）。3.宫颈癌组织中DAPK基因启动子甲基化率（65.4%,34/52）,高于CIN（18.3%,11/60）和正常宫颈组织（0%,0/20）,三组差异有统计学意义（χ²=39.639,P=0.000）。其中,宫颈癌组织与CIN差异有统计学意义（χ²=25.658,P=0.000）,而CIN与正常宫颈组织差异无统计学意义（χ²=2.846,P=0.092）。4.宫颈鳞癌组织中DAPK启动子甲基化率（80.0%,32/40）显著高于腺癌（16.7%,2/12）,差异有统计学意义（χ²=13.680,P=0.000）,但与宫颈癌的组织学分级、临床分期和淋巴结转移无关（分别为χ²=1.010,P=0.604;χ²=0.000,P=1.000;χ²=0.047,P=0.828）。5.88.2%（30/34）发生DAPK基因启动子甲基化的宫颈癌组织中,DAPK蛋白表达缺失。仅5.6%（1/18）的非甲基化宫颈癌组织中,DAPK蛋白表达缺失。统计分析结果显示DAPK基因启动子甲基化和DAPK蛋白表达呈负相关（r=-0.802,P=0.000）。6.DNMT1 mRAN表达与DAPK甲基化呈正相关（r=0.308,P=0.000）。7.MSP检测HeLa细胞系中DAPK基因启动子甲基化状况,结果显示用DAPK基因启动子特异性甲基化引物扩增出目的基因带,片段大小为98 bp,而非甲基化引物未扩增出目的基因带,提示HeLa细胞中存在DAPK基因甲基化。第三部分pshRNA-DNMT1表达载体的构建及其对宫颈癌细胞株HeLa生物学行为的影响方法1.设计三对针对DNMT1表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSilencer3.1-H1中,构建3个重组质粒,分别命名为pshRNA-DNMT1-A,pshRNA-DNMT1-B和pshRNA-DNMT1-C,将重组质粒转化大肠杆菌JM 109菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。2.利用无内毒素的大提质粒试剂盒分别制备无内毒素的pshRNA-DNMT1-A,B和C重组质粒。3.将pshRNA-DNMT1-A,B和C重组质粒分别通过脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染宫颈癌HeLa细胞,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出RNA干扰效果最佳的重组质粒。4.采用RT-PCR和Western blotting分别检测未转染组、转染空载体组及转染重组质粒组DNMT1基因mRNA和蛋白表达。5.采用MSP检测未转染组、转染空载体组及转染重组质粒组HeLa细胞中DAPK基因甲基化状况。6.采用CCK-8试剂盒检测未转染组、转染空载体组及转染重组质粒组HeLa细胞增殖能力的变化。7.采用流式细胞术检测未转染组、转染空载体组及转染重组质粒组HeLa细胞周期和细胞凋亡的变化。8.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差（（?）±s）表示,多个样本均数比较应用单因素方差分析。以α=0.05为显著性检验标准。结果1.成功构建了靶向DNMT1的3个shRNA重组质粒载体pshRNA-DNMT1-A,pshRNA-DNMT1-B和pshRNA-DNMT1-C;酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实载体构建成功。2.重组质粒干扰效果筛选结果表明,重组质粒pshRNA-DNMT1-A,B均能有效抑制宫颈癌细胞中DNMT1基因的表达,其中pshRNA-DNMT1-B的抑制效果最佳,然而重组质粒pshRNA-DNMT1-C对DNMT1基因的表达没有影响。3.RT-PCR结果表明重组质粒pshRNA-DNMT1-B转染HeLa细胞后24 h开始出现DNMT1 mRNA表达量减少（抑制率为24.39%）,48 h抑制率明显升高（64.43%）,72 h作用最强（80.63%）。同样,Western blotting结果也证实,转染后24h开始出现DNMT1蛋白表达量减少（抑制率为31.13%）,48 h抑制率明显上升（72.89%）,72 h作用最强（87.36%）。无论是RT-PCR还是Western blotting结果与对照组相比均有统计学意义（P＜0.05）。4.MSP结果显示转染重组质粒后宫颈癌HeLa细胞中出现DAPK甲基化和非甲基化两条条带,即其甲基化状态发生了部分逆转,而未转染和转染空载体组仅出现一条甲基化条带。5.CCK-8结果显示转染重组质粒后宫颈癌HeLa细胞株的生长明显受抑制,转染重组质粒组的吸光度值与未转染组比较,在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h各时间点差异均有统计学意义（P＜0.05）,转染空载体与未转染相比差异无统计学意义（P＞0.05）。6.流式细胞术结果显示转染重组质粒后G0/G1细胞上升,在24 h、48 h、72 h各时间点与未转染组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,而转染空载体与未转染组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;转染重组质粒后S期细胞下降,在24 h、48 h、72 h各时间点与未转染组两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,而转染空载体与未转染组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。7.转染重组质粒组在24 h、48 h、72 h各时间点的凋亡率与未转染组进行两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,转染重组质粒组各时间点间的凋亡率进行两两比较差异也有统计学意义,以转染72 h组为最高（P＜0.05）,转染空载体与未转染组之间细胞凋亡率无统计学意义（P＞0.05）。结论1.宫颈癌和CIN组织中DNMT1 mRNA表达高于正常宫颈,且宫颈癌HeLa细胞中亦存在DNMT1 mRNA及蛋白表达,提示DNMT1过表达可能在宫颈癌的发生发展中起重要作用。2.宫颈癌组织中DAPK蛋白表达明显低于CIN和正常宫颈组织,并与宫颈癌的临床分期相关,提示DAPK表达下调参与了宫颈癌的发生发展。3.宫颈癌组织中DAPK基因启动子甲基化率显著高于CIN和正常宫颈组织,并与其蛋白表达呈负相关,而且宫颈癌HeLa细胞系中DAPK基因甲基化阳性,提示DAPK启动子甲基化与宫颈癌的发生有关,并且可能是DAPK基因失活的一个重要机制。4.DNMT1 mRNA表达与DAPK甲基化呈正相关,提示DNMT1过表达可能是DAPK高甲基化的机制之一。5.通过RNA干扰技术能成功抑制宫颈癌细胞中DNMT1基因的表达,并使DAPK基因甲基化状态发生部分逆转。6.下调DNMTI基因的表达可抑制宫颈癌细胞的增殖,促使细胞周期静止在G0/G1期,并且诱导细胞凋亡。