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第一部分携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)mRNA的shRNA真核表达载体,并检测重组质粒对DNMT1的沉默效应。方法设计一条针对靶基因DNMT1 mRNA的shRNA序列和一条阴性对照序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA和阴性对照质粒(HK)。将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5α中,经筛选后对提取质粒进行酶切鉴定和测序分析。将构建的重组质粒转染到T24细胞中,用RT-PCR和Western blot检测其在24、48和72h mRNA和蛋白的表达变化。结果重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确;DNMT1 mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为28.44%、52.48%和70.91%;其蛋自在24、48和72 h的抑制率分别为24.27%、57.79%和69.74%。结论成功构建了pGensil-1-DNMT1-shRNA真核表达载体并能有效的沉默T24细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达。第二部分携带DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT3b基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰序列。方法以基因DNMT3b mRNA为靶序列设计3条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3b-shRNA2、pGensil-1-DNMT3b-shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT-PCR和Western-blot检测各组质粒对DNMT3b mRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT-PCR结果经图象分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b mRNA的抑制率分别为20.44%、79.91%和54.48%;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17.27%、77.74%和56.79%。结论成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA(1、2、3),并筛选出pGensil-1-DNMT3b-shRNA2为沉默效应最强的质粒。第三部分携带DNMT1-shRNA和DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1和DNMT3b基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNMT1 mRNA和DNMT3b mRNA的shRNA真核表达载体,并检测重组质粒对DNMT1和DNMT3b的沉默效应。方法用HindⅢ+EcoRⅠ对已成功构建的质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1和pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA进行双酶切,回收质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1的小片段(含DNMT1-shRNA)和质粒pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA的大片段(含DNMT3b-shRNA),构建质粒pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b;对构建质粒进行酶切鉴定和测序分析;用RT-PCR和Western blot检测其对DNMT1和DNMT3b mRNA和蛋白的抑制效率。结果重组质粒经MluI+EcoRI酶切鉴定和测序分析,结果设计序列一致;DNMT1mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为28.79%、57.88%和80.24%;DNMT3b mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为23.88%、52.82%和81.87%;DNMT1蛋白在24、48和72 h的抑制率分别为31.73%、58.27%和82.09%;DNMT3b蛋白在24、48和72h的抑制率分别为35.83%、59.87%和65.84%。结论成功构建了携带DNMT1-shRNA和DNMT3b-shRNA两条shRNA真核表达载体,并能有效沉默DNMT1和DNMT3b的表达,为下一步实验奠定了基础。第四部分shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体外研究目的观察shRNA沉默DNMT1、DNMT3b以及联合沉默DNMT1和DNMT3b的表达对膀胱癌T24细胞增值和凋亡的影响,初步探讨DNMT1和DNMT3b在抑癌基因启动子区域CpG岛甲基化和膀胱肿瘤形成过程中的作用。方法实验分为空白对照组、pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1-1-shRNA1-shRNA3b组;常规培养膀胱癌T24细胞,用脂质体lipofectamine 2000TM将各重组质粒转染进入膀胱癌T24细胞,用RT-PCR、Western blot检测各重组质粒对T24细胞中DNMT1和DNMT3b的沉默效率;用MTT和Annexin-VFITC/PI双染法流式细胞仪检测检测各重组质粒对T24细胞增值和凋亡的影响。结果各重组质粒成功转染进入膀胱癌T24细胞;转染72 h后,各组重组质粒能有效抑制相应基因的mRNA和蛋白的表达;pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组在24、48和72 h的细胞生长抑制率分别为(12.45±1.98)%、(21.76±3.54)%和(37.07±4.23)%,较其他各组抑制明显,并和其它各组之间在三个时间点上均有显著性差异(P<0.05);pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组在24、48和72 h的细胞凋亡率分别为(10.36±1.98)%,(20.23±3.62)%和(32.96±4.82)%,和其他各组在三个时间点上均有统计学差异(P<0.05)。结论联合沉默基因DNMT1和DNMT3b的表达比单独沉默能更显著的抑制细胞增值和促进细胞凋亡,揭示了它们在抑癌基因启动子区域CpGd的超甲基化和膀胱肿瘤形成过程中存在协同作用。第五部分shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体内研究目的观察沉默基因DNMT1、DNMT3b及联合沉默DNMT1和DNMT3b对裸鼠荷瘤生长的影响,初步探讨DNMT1和DNMT3b在膀胱肿瘤形成过程中的作用及相互关系。方法建立裸鼠膀胱肿瘤模型,成瘤后随机分成4组;一组为空白对照,另外三组瘤内分别注射含有重组质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1、pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA和pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b的转染试剂,连续四次,每次间隔5天,此期间观察瘤体体积变化、绘制肿瘤生长曲线;处死裸鼠取出标本并制作石蜡切片,用免疫组化方法检测增值细胞核抗原(PCNA)在T24细胞中的表达;用TUNEL法检测T24细胞凋亡情况。结果成功构建了裸鼠荷瘤模型,空白对照组肿瘤体积随着时间的延长继续增大,注射转染试剂后pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA组瘤体增长略有减缓,pGensil-1-DNMT1-shRNA1组生长出现平台,pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组瘤体则明显变小甚至消失;PCNA检测中,pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组阳性表达分别为50%、83.36%和22.73%;pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组对肿瘤细胞增值能力的抑制明显高于其它各组;在凋亡检测中,pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1.1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组阳性表达分别为59.09%、22.72%和81.09%pGensil-1.1-shRNA1-shRNA3b组对肿瘤细胞的凋亡作用明显高于其它各组。结论DNMT1对膀胱肿瘤生物学行为的影响起主要作用,但没有DNMT3b起辅助作用,其作用明显降低,实验结果揭示了DNMT1和DNMT3b在CpG岛甲基化过程中存在协同作用,并共同促进了膀胱肿瘤的形成。