背景和目的：肝移植是治疗终末期肝病的最有效方法。然而供肝来源短缺使得很多终末期肝病患者在等待供肝过程中失去治疗机会。我国人口基数较大，终末期肝病患者相对较多，器官短缺现象尤为突出，如能利用脑死亡供者(brain-dead donor，BDD)肝脏进行移植，将是缓解供肝来源短缺的有效途径之一。因此，对脑死亡状态下肝脏形态与功能的变化进行研究，可为将来有效利用脑死亡供肝提供理论依据。以往研究表明脑死亡对肝脏具有损伤作用。Olinga等在大鼠脑死亡动物实验中研究证实，脑死亡可导致肝组织IL-10、IL-1βmRNA上调，认为其机制可能与枯否氏细胞、窦内皮细胞激活有关。Van Der Hoeven等人在同样的动物模型中发现ICAM-1、VCAM-1、CD45阳性T淋巴细胞在脑死亡组动物肝脏中均有表达，而对照组表达较少，推测这些炎症介质的表达和炎性细胞浸润与脑死亡有关。正是这种炎症介质的大量表达，易诱发移植器官与受体免疫系统相互作用，产生免疫应答，从而影响移植后供体器官的近期与远期功能状态。虽然大量研究表明脑死亡能引起肝脏功能形态的改变及炎症性、免疫性损伤，但其具体机制尚不清楚。核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)与炎症反应和免疫应答密切相关，调控着细胞因子、生长因子及细胞黏附分子等多种基因的表达。NF-κB过度激活是否为脑死亡致肝脏损伤的机制之一，尚待研究。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)是NF-κB抑制剂，有可能减轻脑死亡状态下肝脏的损伤。本研究拟利用长白猪建立稳定的脑死亡动物模型，探讨NF-κB在脑死亡状态下肝脏损伤中的作用及PDTC对肝脏损伤的保护作用，以期为临床更好地利用脑死亡供肝提供理论依据。本实验共分三部分第一部分猪脑死亡模型建立及建立过程中血压、心率变化目的采用改进的缓慢间断颅内加压法建立猪脑死亡模型，观察建立过程中血压、心率变化，为研究猪脑死亡状态对肝脏形态、功能及免疫原性的影响提供稳定的实验动物模型。方法长白猪12头，雌雄不限，体质量(25±4)kg。随机分为对照组(C组)和脑死亡组(B组)，每组6头。C组维持麻醉24h，仅行开颅术并颅内放置Foley气囊导管，不建立脑死亡模型；B组应用改进的缓慢间断颅内加压法建立脑死亡模型，通过呼吸、循环支持维持猪脑死亡状态24h。监测2组动物在实验过程中平均动脉压(mean artery pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)等血流动力学参数；B组记录脑电图变化。应用SPSS 11.5分析软件，采用单因素方差分析进行统计处理。结果1 B组6头猪均成功建立脑死亡模型。2实验过程中血压、心率变化2．1经Foley气囊导管缓慢间断颅内加压后，B组动物血压、心率缓慢下降后骤然升高，呼吸频率减慢、呼吸幅度加深，平均峰值动脉压(220.33±16.28 mmHg)和平均峰值心率(266.33±21.83次／分)与颅内加压前MAP(106.50±7.26 mmHg)、HR(102.00±4.77次／分)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；2．2脑死亡后6、12和24h，B组猪MAP和HR与C组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。3 B组猪脑死亡前均出现“抽搐反应”，表现为短暂的、无序性全身抽搐，心率、血压骤升，脑电波受影响而呈现波形紊乱。4 B组猪脑死亡状态下的生命体征均符合脑死亡供体的要求。经呼吸和循环支持，B组猪脑死亡状态可稳定维持24h，达到预定时间后，撤除呼吸机并停止循环支持，短时间内脑死亡猪全部“心肺死亡”。第二部分脑死亡对猪肝脏功能与形态的影响、影响机制及其损伤防护目的利用第一部分脑死亡模型，探讨脑死亡对猪肝脏功能、形态的影响及核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)在其发生机制中的作用。并进一步探讨PDTC对其损伤的防护作用。方法长白猪18头，雌雄不限，体质量(25±4)kg。随机分为3组，即对照组(C组)、脑死亡组(B组)及PDTC处理组(P组)，每组6头。C组维持麻醉24h，仅行开颅颅内放置Foley气囊导管与开关腹手术，不建立脑死亡；B组按照本论文第一部分所述方法制作脑死亡模型，但不行药物干预；P组建立脑死亡，于确认脑死亡后PDTC按15mg／kg加入100ml生理盐水中，经静脉缓慢滴注。分别于脑死亡后6、12和24h开腹取血清及肝脏组织，自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase，AST)水平，ELISA法检测血清白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-al水平；实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chainreaction，real-time PCR)法检测肝组织NF-κB mRNA的变化；免疫组织化学方法观察肝组织NF-κB p65蛋白表达水平；HE染色观察肝脏组织形态学变化。应用SPSS 11.5分析软件，采用单因素方差分析进行统计处理。结果1脑死亡后6、12和24h血清ALT、AST水平，C组各时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组及P组每后一时间点与前一时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；3组12、24 h时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。6h时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。2脑死亡后6、12和24 h血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平，C组各时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组及P组每后一时间点与前一时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；3组间各对应时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。3脑死亡后6、12和24h肝组织NF-κB mRNA转录水平及蛋白表达水平，C组各时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组及P组每后一时间点与前一时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；3组各对应时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。4 C组各时间点光镜下肝细胞形态结构正常，24h光镜下未见明显细胞水肿；B组脑死亡后6h肝脏外观及光镜下无明显改变，12h仅见肝细胞轻度浊肿，24h出现细胞水肿、肝窦受压、肝细胞疏松化，但未见肝细胞坏死；P组脑死亡后12h变化较B组轻微，24h与12h相比无明显变化。第三部分脑死亡对猪肝脏免疫原性的影响及其机制目的利用第一部分脑死亡模型，探讨脑死亡状态对猪肝脏免疫原性的影响及NF-κB在其发生机制中的作用。并进一步探讨PDTC对脑死亡猪肝脏免疫原性的影响。方法长白猪18头，雌雄不限，体质量(25±4)kg。随机分为3组，即对照组(C组)、脑死亡组(B组)及PDTC处理组(P组)，每组6头。模型建立及处理同论文第二部分，分别于脑死亡后6、12和24h开腹取肝脏组织，实时荧光定量PCR法检测肝组织NF-κB、细胞间粘附因子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平的变化，免疫组织化学方法观察肝组织NF-κB、ICAM-1、MCP-1、主要组织相容性抗原Ⅱ(major histocompatibility antigenⅡ，MHC-Ⅱ)蛋白表达水平。应用SPSS11.5分析软件，采用单因素方差分析进行统计处理。结果1脑死亡6、12和24h肝组织NF-κB、ICAM-1、MCP-1 mRNA转录水平，C组各时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组及P组每后一时间点与前一时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；3组各对应时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。2脑死亡6、12和24h肝组织NF-κB、ICAM-1、MCP-1、MHC-Ⅱ蛋白表达水平，C组各时间点比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组及P组每后一时间点与前一时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；3组各对应时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。1应用改进的缓慢间断颅内加压法可成功制作猪脑死亡模型，经有效的呼吸和循环支持，能稳定地维持猪脑死亡状态24h，明显提高了模型制作成功率，为进一步研究脑死亡状态下猪肝脏形态和功能变化提供了坚实基础。2猪脑死亡前均出现“抽搐反应”，初步认为这一现象的消失可作为脑死亡的判定指标之一。3脑死亡导致猪肝脏出现功能与形态学的损伤性变化，机体TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质的合成与释放增加。其机制可能是脑死亡引起肝细胞NF-κB mRNA转录和蛋白翻译水平升高，进而导致机体炎症介质合成与释放。4脑死亡后猪肝脏NF-κB、ICAM-1、MCP-1 mRNA转录和蛋白翻译水平均升高，肝脏组织MHC-Ⅱ蛋白表达增多，肝脏免疫原性增强。可能的机制为脑死亡引起肝细胞NF-κB的活化，进而导致机体炎症介质水平升高及肝脏免疫原性增强。5脑死亡猪经PDTC处理后，肝脏组织NF-κB mRNA转录和蛋白翻译水平均降低，炎症介质的释放减少，肝脏炎性损伤减轻。6脑死亡猪经PDTC处理后，肝脏组织NF-κB、ICAM-1、MCP-1 mRNA转录和蛋白翻译水平均下降，肝脏组织MHC-Ⅱ蛋白表达减少，肝脏免疫原性降低。7 PDTC减轻肝损伤的机制可能是其抑制了NF-κB的活化，降低了脑死亡状态下机体炎症介质、细胞因子、免疫分子的释放，降低了脑死亡状态下猪肝脏的免疫原性，并最终保护了脑死亡状态下猪肝脏的结构及功能。