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肝脏一度被看作是放射抗拒器官,但现代基础与临床研究认为肝癌细胞是晚反应组织,其α/β＞10Gy,即为放疗敏感组织,类似于低分化鳞癌。EGFR在肝癌中过表达,与肿瘤的侵袭性生长特点关系密切。在EGFR过度表达的肿瘤细胞中,没有相应配体存在时,治疗剂量照射能导致EGFR表达增加。辐射激活EGFR引起的细胞增殖能力和DNA修复能力增加是一种保护效应,如能阻断EGFR的功能就能预防这种保护效应,将EGFR作为提高放射敏感性的治疗靶点,从而提高放射敏感性。
本实验旨在通过体外研究观察小分子EGFR酪氨酸激酶活性阻滞剂Gefitinib对人肝癌Bel7402细胞株的放射敏感性,检测Gefitinib是否参与调控DNA损伤修复蛋白Mrell的表达,进一步探讨放射增敏的机制,为分子靶向药Gefitinib作为放射增敏剂的应用提供理论依据。
目的:研究EGFR酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib与放疗联合作用于人肝癌Bel7402细胞株,探讨Gefttinib对放疗有无增敏作用及增敏机制。
方法:采用MTT法测定不同浓度Gefitinib对肝癌Bel7402细胞株的生长抑制率;克隆形成实验观察不同浓度Gefitinib联合不同放射治疗剂量对肝癌Bel7402细胞株的放射增敏作用,计算细胞存活率,拟合生存曲线并计算放射生物学参数;流式细胞技术检测Gefitinib与放射治疗单独或联合作用肝癌Bel7402细胞株后细胞周期分布状况。Western blot方法检测Gefitinib与放射治疗单独或联合作用肝癌Bel7402细胞株后Mre11蛋白的表达情况。
结果:
1.MTT实验结果表明,Gefitinb单独作用于肝癌Bel7402细胞株具有对细胞生长抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)为7.26μmol/L。拟合生长抑制曲线可见抑制的程度与药物作用浓度有关系,随着药物浓度提高,细胞抑制作用增加,细胞抑制率呈现剂量依赖关系。
2.肝癌Bel7402细胞株在不同放射剂量联合0.1×IC50Gefitinib及0.2×IC50Gefitinib剂量下生存分数(SF)与单纯放射治疗相比其差别均有统计学意义(P＜0.05)。其放射增敏比(SER)分别为1.2375和1.3456:从细胞存活曲线可见,无Gefitinib作用时单纯照射组处理的肝癌Bel7402细胞株的平均致死剂量(Do)3.1475Gy,准阈剂量(Dq)3.5055Gy,照射2Gy时细胞存活率(SF2)0.8995均高于0.1×IC50Gefitinib及0.2×IC50Gefitinib两种药物浓度加射线处理组。随着Gefitinib剂量的增加,肝癌细胞的放射敏感性也相应增加,放疗与药物协同作用于肝癌细胞Bel7402的效果明显,并表现出一定的药物剂量依赖性。
3.肝癌细胞Bel7402经Gefitinib处理后,G0/G1期细胞比例增加,G2/M期细胞比例轻微增加,S期细胞比例减少;单纯射线6Gy照射后,G2/M期细胞比例显著增加,而S期细胞比例减少;当Gefitinib与放疗6Gy射线联合应用时,G2/M期细胞比例显著增加外,G0/G1期及S期细胞比例减少,S期比例显著低于单纯加药组或放疗组。(P＜0.05)。
4.单药Gefitinib对肝癌Bel7402细胞株Mre11蛋白的表达较对照组无明显变化,单纯放射治疗及0.2×IC50Gefitinib与放射治疗联合可使Bel7402的Mre11蛋白表达明显下降(P＜0.05)。
结论:
1.Gefitinib对肝癌Bel7402细胞株有抑制增殖作用,其IC50值为7.26μmol/L。
2.Gefitinib在低细胞毒性浓度下对肝癌Bel7402细胞株有放射增敏作用,并随着药物浓度的增加,放射生物学参数及细胞存活曲线表明其放射增敏作用增强。
3.Gefitinib与射线协同作用于肝癌Bel7402细胞株后放射敏感的G2/M期阻滞增加,放射耐受的S期比例下降。
4.单药Gefitinib对肝癌Bel7402细胞株Mre11蛋白的表达较对照组无明显变化,单纯放射治疗及0.2×IC50Gefitinib与放射治疗联合可使Bel7402的Mre11蛋白表达明显下降,推测Gefitinib可能通过下调Mre11蛋白的表达增加细胞放射敏感性。