【摘 要】
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金银花（Lonicera japonica）是我国传统中药,具有消炎抗菌、抗血栓、抗病毒等药用价值,在食品、化妆品、日用化工品、生态保护等领域中也发挥了重大作用。类病毒是单链共价闭合的环状RNA分子,不编码蛋白质,侵染力和传染性强、潜伏期较长、检测和防治都较为困难,侵染寄主后可造成严重影响。本实验论文以感染了类病毒的金银花植株为研究材料,运用小RNA测序技术、一步法RT-PCR技术、构建侵染性克隆
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金银花（Lonicera japonica）是我国传统中药,具有消炎抗菌、抗血栓、抗病毒等药用价值,在食品、化妆品、日用化工品、生态保护等领域中也发挥了重大作用。类病毒是单链共价闭合的环状RNA分子,不编码蛋白质,侵染力和传染性强、潜伏期较长、检测和防治都较为困难,侵染寄主后可造成严重影响。本实验论文以感染了类病毒的金银花植株为研究材料,运用小RNA测序技术、一步法RT-PCR技术、构建侵染性克隆和酵母单杂交技术对其展开研究,现得到如下实验结果:通过对在山西临汾金银花种植基地中发现的具有矮化、叶片卷曲的金银花植株进行小RNA测序后鉴定出了一种金银花类病毒,克隆得到了406bp的全长基因组序列。将金银花类病毒与18个不同类病毒分离物进行核酸一致性和系统发育分析,结果表明金银花类病毒与其他18株类病毒的核苷酸同一性范围是55.56%-95.67%,与NC＿001351.1（HSVd）的核苷酸同源性最低,为55.56%;与NC＿010308.1（PVd）的核苷酸同源性最高,为95.67%。系统进化树结果表明金银花类病毒与来自日本（NC＿010308.1）和韩国（LC006862.1）的柿子类病毒亲缘关系较近。对金银花类病毒的二级结构进行预测,结果显示其二级结构呈棒状,A+U占总碱基的40.40%,C+G含量为59.60%,具有30个“环”结构,在二级结构中上、下两链中的12nt-27nt和94nt-108nt位置处分别含有苹果绣果类病毒属（Apscaviroid）的左末端保守区和中央保守区序列。将金银花类病毒与Apscaviroid属不同成员的核苷酸序列进行多重序列比对,结果发现变异区域较多,而与Apscaviroid属中柿子类病毒基因组的差异较小。基于以上系统进化树结果、核苷酸一致性分析及多重序列比对结果,本研究中的金银花类病毒可能是柿子类病毒的变种。我们将金银花类病毒的全核苷酸序列克隆到p GEM-T Easy载体中,构建了金银花类病毒的侵染性克隆,并运用农杆菌介导的烟草接种法对金银花类病毒进行了侵染性研究。生物学观察以及RT-PCR分子检测结果表明,在烟草叶片侵染部位和新生叶上均检测到了金银花类病毒,侵染性克隆构建成功。为进一步研究金银花类病毒致病机制,本研究构建了金银花c DNA文库,并对文库质量进行鉴定。鉴定结果显示金银花c DNA文库的库容量大于1.0×10~6,重组率在98%以上,平均插入片段长度大于等于1000bp,文库质量较好,可以用于后面的实验研究。运用酵母单杂交技术将金银花类病毒诱饵表达载体与金银花c DNA文库载体共转入酵母菌株后筛选鉴定出了14个与金银花类病毒互作的蛋白因子,包括核糖体蛋白S13、水通道蛋白TIP1-1、生长素抑制蛋白ARP、分支点结合蛋白和14-3-3-like D蛋白等。我们推测,金银花类病毒与14-3-3-like D蛋白的互作阻碍了赤霉素的信号传导过程,造成了金银花的矮化。本研究克隆获得了金银花类病毒基因组,明确了该类病毒分子结构,变异特征、分类地位,筛选获得了互作蛋白,初步解析了致病机制,为明确金银花类病毒的RNA分子结构及致病机制提供了理论基础。
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