论文部分内容阅读
梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidun,TP）感染引起的性传播疾病,具有高度传染性,是严重危害人类健康的传染病之一。近年来我国梅毒发病率呈明显上升趋势,因此,在蛋白或核酸水平建立梅毒的快速、高灵敏检测方法对该病的预防、治疗及预后至关重要。血清学检测梅毒螺旋体抗体是目前临床诊断梅毒的重要方法,包括性病实验室研究试验（VDRL）、荧光螺旋体吸收试验（FTA-ABS）、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。近年来,随着梅毒螺旋体TP人工重组抗原技术的进步,以酶标板为载体,结合梅毒混合抗原,通过免疫学双抗原夹心比色法检测梅毒抗体已成为国内三甲级以上医院通用的诊断方法,也是血站对梅毒螺旋体IgM和IgG抗体筛查的指定方法,但方法灵敏度尚需进一步提高。鉴于灵敏度较高的核酸检测方法尚无法在医院和血站大规模推广,因此,提高梅毒螺旋体抗体免疫学检测方法的灵敏度具有重要意义。结合磁性纳米粒子的超顺磁性和金表面生物分子可修饰性的双重特质,本课题组研制了Fe3O4/Au磁性复合微粒,并将其实现了商业化(金磁微粒GoldMag?)。本研究以金磁微粒为载体,结合化学发光检测系统,建立了TP抗体的磁酶免化学发光检测方法。研究内容包括4个部分:①TP混合抗原免疫磁珠的制备;②磁分离酶联免疫反应条件的优化;③化学发光检测系统的优化;④TP抗体磁酶免化学发光法检测方法的评价。将重组梅毒螺旋体混合抗原（包括TP47、TP44.5、TP17和TP15）包被在金磁微粒（平均粒径5μm）表面,在与被检样品以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的混合抗原的双抗原夹心酶联免疫反应后,HRP结合在磁粒表面,然后引入化学发光物质鲁米诺,通过HRP催化鲁米诺的化学发光强度的读取实现对样品中梅毒螺旋体抗体的检测。结果表明,TP抗原包被量为5μg/mg,方阵实验结果显示HRP标记抗原的最佳工作浓度为1:3000稀释,选择免疫学反应的温育时间为30 min,以1×PBS缓冲液（pH 8.0）为化学发光缓冲介质,鲁米诺、过氧化氢及对碘苯酚的浓度分别为1×10-3mol/L,1×10-3mL/L和3×10-3mol/L,建立了TP阳性血清稀释倍数与其相对发光强度之间的标准曲线,方法具有良好的线性关系,R2:0.9988。与以酶标板为载体测定TP抗体的商品化试剂盒（ELISA法）做了比较,单纯以金磁微粒为固相载体的检测灵敏度可提高2倍,若进一步引入化学发光检测系统,其灵敏度可提高16倍。本方法对阳性血清重复测定11次的结果显示,其相对标准偏差（RSD）为5.5%。以金磁微粒为载体的TP抗体磁酶免化学发光法具有灵敏度高,操作简单的优点,该方法对标准血清盘的测试仍在进行中,方法在血站筛查及临床检测领域具有潜在的应用价值。