巨噬细胞是由血液中的单核细胞迁移出血管进入组织和器官后分化形成,作为人体中吞噬作用最强的细胞,其通过其吞噬功能和免疫信息传递功能在人体的非特异性和特异性免疫过程中发挥重要作用。通过识别病原体的组分,巨噬细胞能够被活化,进而吞噬入侵的病原体,同时释放炎症相关的细胞因子。然而,过多的炎症因子分泌也会导致炎症反应的加剧,进而对临近的组织以及巨噬细胞自身造成损伤。杨芽黄素是一种黄酮类化合物,其存在于中药材如益智仁,以及一些药食同源的植物如小花山奈、或可食用的果实如文定果、山胡桃中。在蜂胶中,杨芽黄素是其主要具有活性的黄酮类成分之一。已有的研究表明,蜂胶提取物具有较好的抗炎活性,也有报道认为杨芽黄素可以在无细胞毒性的剂量下通过抑制LPS刺激的巨噬细胞中一氧化氮合酶(iNOS)的活性抑制炎症因子NO的分泌,提示其可能作为蜂胶中主要具有抗炎活性的成分之一。然而目前的研究却没有关于杨芽黄素抗炎作用的明确报道,更无相关研究阐明其发挥抗炎作用的机制和靶点。基于此,我们决定对杨芽黄素发挥抗炎作用的潜在机制展开研究。研究结果表明,在LPS刺激的RAW264.7细胞模型中,杨芽黄素能够显著抑制炎症相关蛋白iNOS,TNF-α,IL-6的转录水平,从而抑制炎症因子NO、TNF-α、IL-6的分泌。进一步的研究表明,在LPS刺激巨噬细胞表面TLR4受体激活的验证相关信号转导通路中,杨芽黄素能够剂量依赖地抑制AP-1信号通路中ERK1/2激酶的磷酸化水平,而对NF-κB信号通路的转录水平以及AP-1信号通路中JNK1/2、p38的磷酸化水平无明显的抑制作用。但是,杨芽黄素并不能抑制ERK1/2上游激酶MEK1/2的磷酸化水平,这提示杨芽黄素发挥作用的环节可能在于阻止活化态的MEK1/2再磷酸化其下游底物ERK1/2。为了进一步确认此推论,我们在非细胞体系的激酶反应中考察了杨芽黄素对MEK1和MEK2的激酶活性的作用,结果表明杨芽黄素能够显著抑制MEK1的酶活,其IC50约为76.95μM,而对于MEK2活性的抑制作用则较弱。我们也利用MOE分子对接软件模拟了杨芽黄素与MEK1蛋白结合的方式,结果表明杨芽黄素可以结合于MEK1蛋白的活性中心,Met146为MEK1与杨芽黄素结合的最主要氨基酸残基。在确定了杨芽黄素的作用靶点为MEK1/2后,我们注意到有报道称,MEK1/2抑制剂可以在巨噬细胞中完全抑制精氨酸酶Ⅱ的表达增加iNOS的表达水平,而NO的生成量则与这两种酶竞争共同的底物L-精氨酸的能力大小有关。针对此与我们的研究结果不相符的报道,我们专门设计实验进行了验证。研究结果显示,杨芽黄素是通过MEK-ERK-iNOS的途径发挥了抑制精氨酸酶Ⅱ的表达水平,从而证明通过竞争共同底物调控NO分泌的作用机制在杨芽黄素的作用机制中并不存在。最后,在LPS刺激的小鼠内毒素血症模型中,杨芽黄素能够明显抑制其血清和腹腔灌流液中炎症因子NO,TNF-α和IL-6的水平,显示出较好的体内抗炎活性。以上研究结果表明,杨芽黄素在巨噬细胞中发挥抗炎作用的机制为直接抑制LPS刺激的巨噬细胞中MEK1/2的活性,进而抑制ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制AP-1信号转导通路的活性,减少下游相关炎症因子的转录和翻译。本研究首次阐明了杨芽黄素在巨噬细胞中发挥抗炎作用的机制,这样的结果也提示富含杨芽黄素的药材或食品具有被用于治疗炎症相关疾病的潜力。并且,由于本研究确定了杨芽黄素的作用靶点为MEK1/2,而MEK-ERK信号通路的重要意义已经在多种疾病的发生发展过程中得以阐明,特别是在肿瘤相关疾病中,针对MEK-ERK信号通路的抑制已经作为治疗黑色素瘤、白血病等肿瘤的有效治疗手段,这也提示杨芽黄素作为能够抑制MEK1/2的天然活性成分,也可能在涉及到MEK-ERK信号通路的其他相关疾病中具有潜在的应用价值。