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目的: (1)克隆人白细胞介素-31(hIL-31)cDNA序列,构建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。 (2)将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体转染COS-7细胞,筛选出稳定表达hIL-31的细胞株,分离并纯化hIL-31蛋白。 (3)使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞,探讨其对IL-6、TNF-αmRNA和蛋白质水平表达的影响。 (4)使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞,探讨其对细胞周期和细胞增殖的影响。 方法: (1)采用淋巴细胞分离液分离获得人外周血单核细胞,培养之后加入终浓度为20nmol/L的PMA,继续培养24h后收集细胞。 (2)Tizol法提取细胞总RNA,RT-PCR扩增hIL-31cDNA序列,并将其构建到真核表达载体pSecTag2/Hygro B上。 (3)使用DNA转染试剂盒将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31转染至COS-7细胞当中,并使用潮霉素进行筛选,获得单个克隆后进行扩大培养,采用核酸蛋白检测仪进行蛋白质的分离与纯化。 (4)使用不同浓度的hIL-31干预HaCaT细胞,采用Real-Time PCR的方法分析其对HaCaT细胞IL-6、TNF-αmRNA表达的影响;ELISA法检测其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α蛋白表达的影响;MTT法分析其对细胞增殖的影响以及流式细胞仪检测对细胞周期的影响。 结果: (1)经菌落PCR、双酶切及测序分析鉴定,成功获得hIL-31基因cDNA全长序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。 (2)成功筛选出稳定表达hIL-31的COS-7细胞株,并分离纯化出IL-31蛋白。 (3)hIL-31能够显著诱导IL-6、TNF-αmRNA和蛋白水平的表达,并具有时间和剂量依赖效应。 (4)小剂量、短时间的hIL-31抑制HaCaT细胞增殖的作用不明显;高剂量、长时间的hIL-31对HaCaT细胞的增殖有一定的抑制作用。 (5)hIL-31可以改变HaCaT细胞周期,使得G1期细胞数量增加,S期和G2期细胞数量减少。 结论: (1)IL-31可以促进HaCaT细胞IL-6和TNF-αmRNA和蛋白水平的表达。 (2)外源性的IL-31可以改变HaCaT的细胞周期,进而抑制细胞增殖,并且其效应具有时间和剂量依赖性。