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第一部分影响精子冷冻复苏效果的因素分析研究目的：探索影响精子冷冻复苏率的精液自身因素,因素主要包括取精季节、禁欲时间、精液质量、精浆ROS水平、精子DNA损伤及精浆等,为提高精子冷冻复苏效果提供实验依据。研究方法：1.回顾性分析了2006年9月至2011年6月来自浙江省人类精子库1624例供精者捐献的14190份精液标本,以了解取精季节、禁欲时间、精液质量对精子冷冻复苏率的影响。2.34份精液标本来源于28例供精志愿者,每份精液标本分成两份,一份添加次黄嘌呤(HX)和黄嘌呤氧化酶(XO),产生活性氧物质,另一份添加磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照,均孵育1h后比较处理组与对照组冷冻复苏率的变化,以了解精浆活性氧水平对精子冷冻复苏率的影响。3.对55份精液标本进行精子DNA碎片率(DFI)检测,同时进行精子冷冻复苏试验,计算精子冷冻复苏率,按精子DFI＜15%及≥15%将标本分为两组,比较两组精子冷冻复苏率变化,以了解精子DNA损伤对精子冷冻复苏率的影响。4.共25份精液标本,每份精液标本分成两份,一份添加高冷冻复苏率精浆作为处理组,另一份添加自身精浆作为对照组,两组均进行精子冷冻复苏试验,比较两组精子冷冻复苏率的变化,以了解不同来源精浆对精子冷冻复苏率的影响。研究结果：1.(1)不同的季节影响精子冷冻复苏率,夏季采集的精液,其前向运动精子冷冻复苏率是67.1%,明显低于春季(69.2%)、秋季(69.0%)及冬季(69.2%),差异具有统计学意义,P＜0.05；春季、秋季及冬季的精子冷冻复苏率无统计学差异,P＞0.05；(2)随着禁欲时间的延长,精子冷冻复苏率明显下降,禁欲3d组精子冷冻复苏率最高(70.3%±15.7%),禁欲7d组精子冷冻复苏率最低(63.7%±17.6%),P＜0.05；(3)精子冷冻复苏率随着精子浓度的升高而明显增加,精子浓度＜60×106/ml组精子冷冻复苏率最低(63.8%±17.4%),精子浓度>120×106/ml组精子冷冻复苏率最高(74.8%+13.1%),P＜0.05,相关性分析发现精子浓度与精子冷冻复苏率呈正相关；(4)冷冻前精子活力影响精子冷冻复苏率,精子活力≤50%组精子冷冻复苏率(66.5%±20.4%)明显低于精子活力51%～60%组及精子活力>60组,P＜0.05,精子活力51%～60%组与精子活力>60%组的精子冷冻复苏率(69.2%±16.3%、69.0%±13.3%)无显著性差异,P＞0.05；(5)精子冷冻复苏率随着形态正常精子百分率的升高而明显增加,形态正常精子百分率≤10%组精子冷冻复苏率最低,仅为53.0%±15.5%；形态正常精子百分率>25%组精子冷冻复苏率最高,高达80.6%±9.9%,P＜0.05,相关性分析发现形态正常精子百分率与精子冷冻复苏率呈明显的正相关,相关系数为0.404。2.精液经添加HX+XO后的处理组与自身空白对照组经孵育1h后,处理组的冷冻复苏后前向运动精子百分率及精子冷冻复苏率(11.44%±9.11%、32.77%±18.85%)明显低于对照组(24.03%±9.09%、47.62%±15.25%),P＜0.05。3.精液标本按DFI<15%及≥15%分两组,DFI＜15%组的冷冻复苏后精子前向运动精子百分率及精子冷冻复苏率(20.63%±11.75%、43.94%±16.63%)明显高于DFI≥15%组(12.92%±8.58%、29.80%±15.39%),P值均＜0.05。相关性分析发现DFI与精子冷冻复苏率呈明显的负相关,相关系数为-0.302。4.精液中添加高复苏率精浆的处理组与添加自身精浆的对照组经冷冻复苏后,对照组的冷冻复苏后前向运动精子百分率及精子冷冻复苏率(21.44%士15.57%、43.77%±38.92%明显低于添加高复苏率精浆的处理组(28.80%±14.52%、58.62%±34.12%),P＜0.05。研究结论：取精季节、禁欲时间、精子浓度、精子活力、精子形态、精浆ROS水平、精子DNA碎片率及精浆来源均会影响精子冷冻复苏率,上述有些指标可以预测精子的耐冻性,通过改善或调整这些影响因素,可以提高精子冷冻复苏率,从而增加合格供精者的人数及冷冻精液的数量。第二部分精子及精浆中蛋白含量和种类差异对精子冷冻的正性与负性作用研究目的：利用二维电泳及质谱技术分离及鉴定出高冷冻复苏率及低冷冻复苏率人群精子及精浆差异蛋白,以发现影响精子耐冻性的蛋白质,从蛋白质组学水平揭示精子冷冻损伤机理并为提高精子冷冻技术水平提供实验依据。研究方法：标本来源于5例高冷冻复苏率及5例低冷冻复苏率供精志愿者的精液,高冷冻复苏率组精液标本共采集11份,精子冷冻复苏率为83.6%士4.8%；低冷冻复苏率组精液标本共采集20份,精子冷冻复苏率为26.1%士7.3%。运行上游法收集活动精子,高速离心收集精浆,硫脲/尿素法提取蛋白并进行定量,使用二维电泳技术进行差异蛋白质分离,应用Image Master图像软件系统对凝胶进行蛋白点定量比对及匹配分析,结合胶内酶解和质谱鉴定技术对分离出的差异蛋白点进行蛋白鉴定。研究结果：本实验研究共发现高复苏率组与低复苏率组精浆中共有35个蛋白丰度出现明显上调或下调的蛋白点；精子中共有26个蛋白丰度出现明显上调或下调的蛋白点。对其中的23个差异蛋白进行质谱分析,发现这些差异蛋白主要与精子的成熟、能量代谢、精子运动、精子细胞骨架及精子DNA修复等有关。研究结论：精子或精浆中与精子成熟、能量代谢、精子运动、精子DNA修复等相关的蛋白含量可能影响人类精子的耐冻性。