论文中包含两部分的工作。第一部分工作：miR23a～27a～24在胚胎干细胞分化中的功能研究了解胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)维持自我更新及多向分化潜能的具体机制,对于人们未来更好的将其应用于再生医学非常重要。过去几十年已经对ESC中转录因子和信号通路层面上的调控机制开展了较全面的研究,也勾画出ESC维持其特征的具体整体框架。除了各种转录因子相互协调形成网络调控外,人们也逐渐认识到表观遗传修饰,如组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA等,也可以协同转录调节因子来共同维持ESC状态基因的表达。其中microRNA在ESC自我更新及分化中发挥了重要的功能,在ESC中将Dicer和DGCR8敲除均显示ESC分化存在缺陷,说明microRNA在胚胎干细胞的自我维持尤其是分化中具有非常关键的作用。人们对于促进ESC自我更新和多潜能性,提高iPS细胞重编程效率的microRNA研究较多。但是,对于抑制ESC自我更新,促进分化的microRNA则研究较少。本课题组在前期的研究工作发现位于小鼠8号染色体上的miR-23a～27a～24-2基因簇(miR-23a基因簇)的两个成员miR-27a和miR-24在分化细胞和组织中呈现不同程度的高表达,通过靶基因Oct4、 Foxo1、 gp130、 Smad3、 Smad4实现对ESC自我更新的抑制,并能够促ESC多胚层分化,抑制二者的表达能显著提高三因子介导的iPS细胞形成的效率,同时有促进胚层特异性分化的相关报道。考虑到上述工作很多是在特定修饰的细胞系或者体外开展,对miR-27a和miR-24-2在ESC分化中是否不可或缺这一问题不能全面回答,miR-23基因家族除了miR-23a基因簇外,还包含有位于13号染色体上的miR-23b～27b～24-1基因簇(简称miR-23b基因簇),这两个基因簇共编码5个microRNA:miR-23a,23b,27a,27b,24。 miR-23b基因簇上三个成员miR-23b,27b,24-1的种子序列与miR-23a基因簇中的三个成员完全相同,因此它们可能具有相同的靶基因及相应的功能,在功能上有代偿作用。因此,我们使用CRISPR/Cas9技术在V6.5细胞系中分别获得miR-23a和23b双基因簇纯合敲除(DKO)和miR-23a基因簇纯合敲除(KO)细胞系,而这是第一次由CRISPR/Cas9技术实现双microRNA基因簇的纯合敲除。而后,我们将获得DKO和KO ESC系通过EB形成实验、ES细胞向中内胚层定向诱导实验和畸胎瘤形成实验确定上述miR-23a/b基因簇敲除ESC系的分化能力。在EB形成实验中,DKO细胞显示导致中胚层分化缺陷而促进其它胚层的分化,提示miR-23-27-24基因簇参与ESC自我更新的抑制和早期中胚层的形成；在心肌分化实验中,DKO ESC 在任意天数都未观察到博动性cEBs,心肌特异标志物Nkx2.5、 Tbx5、a-MHC、 b-MHC和cTnT等的表达量明显降低。免疫荧光试验显示没有明显的肌原纤维形态,三个心肌标志物Actinin、 ANP和Troponin1的表达量也非常低,提示miR-23～miR-27～miR-24基因簇在心肌细胞分化中起着非常重要的作用；同过畸胎瘤体积大小和重量检测显示DKO ESC成瘤能力小于KO和野生型ESC,通过HE染色,DKO ESC来源的畸胎瘤中可以观察到外、内胚层的结构,而几乎没有中胚层的结构,并且存在大量未分化或低分化的区域；通过ESC的标志物Oct4进行免疫组化检测,发现DKO ESC来源的畸胎瘤中存在大片Oct4染色阳性区域,而野生型ESC来源的畸胎瘤中则几乎没有,KO ESC来源的畸胎瘤介于两者之间。第二部分工作：单倍体胚胎干细胞突变体文库的建立和应用研究表明转录因子Oct4与Sox2是维持多能性所必须的,它们与其它一些转录因子共同组成了一个调控网络来建立及维持ESC的多能性。当这一调控网络被破坏时,ESC将退出多能性(Exit from Pluripotency)走向分化,但是,对于这一过程的机制,还有很多疑问有待人们研究,目前在国际上已经有几个研究团队利用正向遗传学筛选(Forward Genetics)方法获得了与调控ESC退出多能性相关的候选基因。但这些研究都有自身的局限性,另外,将这些遗传筛选的结果放在一起分析会发现相互间的重复性很差,只有少数几个基因(如Tcf3)在不同研究中都被筛选出来,这也从侧面说明上述研究还远没有全面揭示ESC退出多能性进入分化状态的相关因子及其作用机制。由于多数基因的性状为隐性的,只有两个等位基因都发生突变时,性状的变化才显现出来,因此获得基因组范围的纯合突变细胞文库是进行正向遗传筛选研究必要条件。haESC只具有一套染色体组,并具有ESC的所有特征,因而,在正向遗传筛选工作具有更广泛的优势,目前,在突变ESC基因的多种方法中,利用病毒载体和转座子载体进行的插入突变是使用较为广泛的方法,而转座子载体没有病毒载体那样显著的基因组整合偏好性,可以覆盖更多的基因。因此我们使用piggyBac转座子载体携带的基因诱捕(Gene Trap)元件在haESC中构建了4个纯合突变体文库,约包含60000个突变克隆,通过Southern blot检测其转座子单拷贝插入插入的比例在74%,通过Splinkerette-PCR结合“三引物竞争性PCR”鉴定纯合突变的比例在85%以上,通过Splinkerette-PCR结合高通量测序的方法确定构建的文库中55%以上的插入位点位于基因内,其约涵盖18000个以上的基因。在此基础上,我们构建了一个包含460个突变克隆的小规模矩阵式突变体文库,所谓“矩阵库”就是在单倍体胚胎干细胞混合库的基础上,将每一个突变克隆挑取到96孔细胞培养板中独立培养。随后利用两种分化条件M15 (-LIF)和N2B27对这些细胞进行了分化筛选,共获得了33个仍可以呈ESC样生长的阳性克隆；利用Splinkerette PCR结合常规测序确定了19个阳性克隆在基因组中的插入位点,其中11个插入位点定位于已知基因,包含已知的与分化和发育相关的基因。接着,我们挑选了两个阳性克隆进行回复实验,当转座子捕获载体被切除后,回复克隆在分化的条件下表现出了明显的分化表型,证明了分化缺陷表型的产生是由转座子的插入引起的。这些结果充分证明了我们将建立的矩阵式突变体文库的可应用性以及筛选策略的可行性,为我们下一步扩大矩阵式突变体文库奠定了良好的基础,通过筛选出更多的分化相关基因使我们能更深入全面地了解ESC分化的分子机制。