【摘 要】
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该研究从分泌抗CD25单克隆抗体的杂交瘤细胞WuTac中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一链,然后分别采用针对V和V相应的PCR引物扩增出V和VDNA片段,其中在V的下游引物和V的上游引物
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该研究从分泌抗CD25单克隆抗体的杂交瘤细胞WuTac中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一链,然后分别采用针对V<,L>和V<,H>相应的PCR引物扩增出V<,H>和V<,L>DNA片段,其中在V<,L>的下游引物和V<,H>的上游引物含有构建Linker的部分重叠互补序列.将V<,L>和V<,H>的PCR回收产物进行部分重叠PCR,即先将V<,L>、V<,H>的回收产物在不加任何引物的条件下先进行7次PCR循环,再加上V<,L>的上游引物和V<,H>的下游引物进行30次PCR循环.PCR产物纯化后与PMD18T克隆载体连接.连接子转化JM109感受态细胞,通过特异性双酶工鉴定筛选出阳性克隆.ScFv基因长度约为700bp.通过DNA序列测定和分析,构建出V<,L>-（GGGGS）<,3>- V<,H>（但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser）和V<,L>-(GGGGS)<,2>-V<,H>两种不同Linker的单链抗体基因.其中V<,L>隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,V<,H>隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ（C）亚类.重组克隆载体（anti-CD25ScFv-PMD18T）与分泌型原核表达载体pBAD/gⅢA（携带有6个单位His和C-myc作为纯化鉴定标签）分别用NcoⅠ和XbaⅠ进行酶切,用T4DNA连接酶将ScFv基因连接到Pbam/gⅢA上.连接子转化入相应的TOP10大肠杆菌中,筛选阳性菌落.L-阿拉伯糖诱导ScFv的表达.SDS-PAGE鉴定其分子量,以激活的T细胞为抗原,ScFv作为一抗,抗His McAb作二抗,用细胞ELASA鉴定其抗体活性.SDS-PAGE和Western-blot结果证明阳性菌落经L-阿拉伯糖诱导后表达为一30KD左右的蛋白质产物,细胞ELASA证明表达产物有抗原结合活性.
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