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基因敲除或导入是研究基因功能的主要手段,其为干细胞多能性维持的分子机制研究提供了大量信息。Nanog基因在胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)系中过量表达可以独立于LIF/Stat3途径维持内细胞团和ESCs的多能性,在3T3细胞系中强迫表达可以提高3T3细胞增殖能力。而表皮干细胞是一种具有很强自我更新能力并可不断产生功能性细胞以维持表皮稳态的成体干细胞。近年来,表皮干细胞在组织工程、细胞治疗上都显示出巨大的应用潜力,其多能性也日益引起人们关注,尽管如此,其多能性和自我更新能力仍远弱于ESCs。实验拟在分离出能于体外大量扩增的表皮干细胞群并鉴定之后,将ESCs多能性关键基因Nanog导入表皮干细胞并观察其对表皮干细胞生物学特性的影响。实验内容和结果如下:1.采取山羊耳部皮肤组织,通过对比酶消化培养法与组织块培养法两种原代细胞获取方法,有血清培养液与无血清培养液两种表皮干细胞培养液,以Ⅳ型胶原差速筛选表皮干细胞,显示酶消化培养法比组织块培养法获取细胞效率更高,且很少有成纤维细胞污染,适合于表皮干细胞的原代分离和继代培养。有血清培养液比无血清培养液更能促进山羊表皮干细胞贴壁成活,再经过Ⅳ型胶原差速筛选所获得的山羊表皮干细胞能够于体外连续传代且大量扩增。在冷冻保存复苏后,仍保持较高活力,适合做Nanog基因转染的靶标细胞。2.通过形态观察,表皮干细胞特异性分子标志免疫细胞化学染色,生长曲线和克隆形成率检测,对分离得到的表皮干细胞进行鉴定。实验分离的表皮干细胞体积小,细胞呈球形、致密,在显微镜下折光性强、胞体透亮,具极强的增殖能力,呈片状克隆生长,绝大多数表达β1整联蛋白、p63、α6整联蛋白,很少表达CK-14,不表达CD71,符合目前所知的表皮干细胞特性的标志。根据其第3、5、7代的生长曲线发现随着代数增高,细胞活力逐渐减弱。其第1、3、5代之间克隆形成率虽然也在下降,但差异不显著,初步认定所获细胞为表皮干细胞,可以用于目的基因转染。3.构建真核表达载体,测定抗生素对表皮干细胞的最小致死量,以脂质体法将pEGFP-Nanog导入山羊表皮干细胞,抗生素筛选阳性克隆,经荧光镜检和RT-PCR鉴定,发现目的基因在表皮干细胞中表达。对转染阳性表皮干细胞进行ESCs特异性标志的免疫细胞化学染色鉴定和克隆形成率检测,发现其表达SSEA-1,SSEA-4和端粒酶且克隆形成率相对较高,明显区别于两组对照。体外培养能够自发分化为神经样细胞,Oct-4阳性,显示Nanog可以促进表皮干细胞表现部分ESCs的生物学特性。