【摘 要】
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凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）具有耐高温、耐低pH、和产高光学纯度L-乳酸等性能,因此在乳酸发酵行业备受关注。在乳酸发酵过程中,使用不同中和剂会造成发酵环境中金属离子的差异,从而影响菌体的生理代谢。且在以玉米质淀粉水解液为原料的混合碳源中,由于分解代谢物阻遏效应,发酵生产过程后期残留的异麦芽糖、海藻糖等严重降低乳酸得率、延长发酵周期和增加后期纯化成本。因此,研究凝结芽孢杆菌乳
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凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）具有耐高温、耐低pH、和产高光学纯度L-乳酸等性能,因此在乳酸发酵行业备受关注。在乳酸发酵过程中,使用不同中和剂会造成发酵环境中金属离子的差异,从而影响菌体的生理代谢。且在以玉米质淀粉水解液为原料的混合碳源中,由于分解代谢物阻遏效应,发酵生产过程后期残留的异麦芽糖、海藻糖等严重降低乳酸得率、延长发酵周期和增加后期纯化成本。因此,研究凝结芽孢杆菌乳酸发酵过程中和剂对代谢的影响以及混合碳源的代谢特性和调控机制有助于优化乳酸发酵工艺和提高碳源利用效率。首先建立了适用于凝结芽孢杆菌胞内代谢物组定量的分析方法。通过不同淬灭方法和破碎方法对该菌胞内代谢物泄漏率和回收率的比较,建立了以60%冷甲醇淬灭和沸乙醇法破碎进行胞内代谢物提取的方法。根据13C同位素内标物标记丰度稀释法的原理,建立了凝结芽孢杆菌胞内19种氨基酸、6种有机酸和11种磷酸糖的定量检测方法。其次,研究了不同中和剂对凝结芽孢杆菌在混合碳源乳酸发酵过程中碳源底物切换状态下菌体自溶的影响。（1）对比葡萄糖与10种不同碳源组合的混合碳源底物对乳酸发酵的影响,结果表明,葡萄糖与海藻糖组合在发酵过程中碳源分级利用情况最明显,为后续研究确定基本实验条件。（2）通过分析摇瓶和5L罐的发酵代谢曲线的差异,实验验证中和剂是造成发酵过程中葡萄糖耗完后菌体自溶差异的关键因素。用NaOH作为中和剂在葡萄糖消耗完后菌体大量自溶,发酵后期有明显的二次生长现象,而用Ca（OH）2作为中和剂可以明显降低菌体自溶率,使得海藻糖利用阶段细胞密度始终维持较高水平,乳酸生成速率明显提高。（3）不同金属离子、渗透压等条件对碳源饥饿环境下菌体自溶和活性的影响研究表明,Ca2+和Mg2+能够缓解菌体自溶。（4）定量代谢物组和转录组数据结果证实:使用Ca（OH）2中和剂时,菌体在葡萄糖消耗完处于饥饿状态下,细胞可能通过上调细胞生长分裂（ftsA ftsE、ftsX、ftsZ、sepF）和中心碳代谢相关基因,同时下调细胞壁水解相关基因（walK、cwlJ）来缓解菌体自溶。最后深入研究了凝结芽孢杆菌在混合碳源下的乳酸发酵过程代谢特性。（1）在5 L生物反应器上进行葡萄糖和海藻糖混合底物发酵过程多参数采集分析,实验结果显示,发酵过程呈现葡萄糖消耗阶段（阶段Ⅰ）、有机酸消耗阶段（阶段Ⅱ）和海藻糖消耗阶段（阶段Ⅲ）。阶段Ⅰ乳酸生成速率为2.04 g/L/h,糖酸转化率为0.89 g/g,副产物（乙酸、乙偶姻）较少。阶段Ⅱ菌体以消耗有机酸为主。阶段Ⅲ乳酸生成速率为0.19 g/L/h,糖酸转化率为0.71 g/g,且副产物（乙酸、乙偶姻）较多。（2）代谢物组和转录组数据分析可知,不同发酵阶段有明显的代谢转变。阶段Ⅰ为同型乳酸发酵以EMP为主要代谢途径。阶段Ⅲ为异型乳酸发酵有更高比例的碳源分配到PKP途径。（3）阶段Ⅰ厚壁菌门诱导物排斥效应机制中的关键基因ccpA和hprK上调,说明凝结芽孢杆菌在葡萄糖和海藻糖存在的情况下,触发了分解代谢物阻遏效应。
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