论文部分内容阅读
目的乳腺癌是女性最普遍的恶性肿瘤之一,在发达国家,它位于所有死亡原因的第二位。与前列腺癌相似,乳腺癌也有易发生骨转移的倾向。有研究表明,骨形成蛋白（BMP）在骨肿瘤的发病和转移中起重要作用,其中BMP-2作用尤其明显。肿瘤新生血管的形成是肿瘤发生侵袭和转移的重要因素,许多血管生长因子在肿瘤中均有不同程度的表达。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growthfactor,VEGF）是其中效力最强的因子之一,它可直接或间接地参与血管新生的每一个过程。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,,MAPK）家族的重要成员,p38MAPK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。有研究表明,BMP-2可能在VEGF介导的血管生成机制中起重要作用,也有人报道p38MAPK信号传导通路可能调节VEGF上调。因此,本研究检测了p-p38,BMP-2及VEGF在乳腺癌组织中的表达情况,并进一步在体外研究p38MAPK通路与BMP-2的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1、材料68例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科,为2003年～2006年手术切除标本。依据WHO2003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类,68例均为浸润性导管癌。人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s、MCF-7及人正常乳腺细胞系10A购自中国协和医科大学细胞库。2、主要试剂兔抗人BMP-2单克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人p-p38单克驴固?#9216)购自Cell Signaling公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（IE-0031）、羊抗鼠（IE-0141）二抗、兔抗人β-actin多克隆抗体（PR-0255）、S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、p-p38特异性抑制剂SB203580、BMP-2特异性抑制剂Nogin、Matrigel胶均自北京中山生物技术有限公司。3、方法（1）免疫组织化学步骤:（采用SP法）以PBS代替一抗设立空白对照,以已知乳腺癌阳性片作为阳性对照。结果判定:在双盲法下进行,BMP-2、VEGF以肿瘤细胞胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达,p-p38以肿瘤细胞胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在光镜下随机选取5个视野,每个视野计数100个瘤细胞。着色强度分为无色（-）为0分,浅黄色（+）为1分,黄色及棕黄色（++）为2分。阳性细胞数分为＜10%为0分,10%-50%为1分,＞50%为2分。两项得分相乘结果≥2记为阳性。（2）Western印迹法:RIPA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗及DAB显色,观察拍照,进行灰度值测定。（3）Transwel法:步骤:用无血清1640以1:3稀释Matrigel,每上室加入Matrigel100微升,37度孵箱中放置了24小时。胰酶消化细胞,细胞计数后稀释至2.5×105cells/ml,取100微升加入上室中,下室加入600微升10%FBS 1640。5%CO237度中培养24小时。固定及染色,切片制作,显微镜下照相并进行细胞计数。4、统计学分析采用SPSS10.0统计学软件,进行x2检验和t检验,确定p＜0.05有统计学意义。结果1、BMP-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移的关系应用免疫组织化学染色显示,BMP-2蛋白主要分布于乳腺癌细胞的胞浆内;VEGF蛋白主要分布于乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的胞浆内,乳腺癌细胞浓染,正常乳腺细胞淡染;p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内,呈棕黄色颗粒。31例有淋巴结转移的乳腺癌患者中23例BMP-2表达阳性,阳性率为74.2%,37例无淋巴结转移的患者15例表达阳性,阳性率为40.5%,差异有显著性（p＜0.01）。VEGF在有淋巴结转移的患者中阳性率为67.7%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为35.1%,差异有显著性（p＜0.05）。p-p38在有淋巴结转移的患者中阳性率为61.3%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为37.8%,差异有显著性（p＜0.05）。2、BMP-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达Western Blot结果显示BMP-2、p-p38、VEGF在高转移细胞系MDA-MB-435s中的表达高于低转移细胞系MCF-7中的表达高于正常乳腺细胞的表达（p＜0.05）。3、加入BMP-2特异性抑制剂Noggin后p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达Western Blot结果显示加入BMP-2特异性抑制剂Noggin（0,12,24,48h）后,MDA-MB-435s细胞系中VEGF、p-p38蛋白的表达明显下降,并且这种下降呈时间依赖性,在48小时达到高峰。4、加入p38特异性抑制剂SB203580后p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达Western Blot结果显示加入SB203580（0,5,10,20uM）后,MDA-MB-435s细胞系中VEGF蛋白的表达明显下降,并且这种下降呈剂量依赖性,在20uM时达到最高峰。5、加入p38特异性抑制剂SB203580、BMP-2特异性抑制剂Noggin后细胞侵袭能力的改变Transwell结果显示加入p38特异性抑制剂SB203580、BMP-2特异性抑制剂Noggin后乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-435s侵袭细胞数分别降低约48%及57%。讨论首先我们研究了BMP-2、p-p38、VEGF在乳腺癌中的表达。结果发现BMP-2、p-p38、VEGF在乳腺癌中高表达,并且有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,这提示BMP-2、p-p38、VEGF的表达与乳腺癌的恶性进展及侵袭转移有关。然后我们假设乳腺癌中BMP-2可能是通过p38MAPK通路来调节VEGF的表达。我们检测了不同侵袭程度的三种细胞系中三种蛋白的表达,Western印迹显示三种蛋白在乳腺癌高侵袭性细胞系435S中的表达均高于乳腺癌低侵袭性细胞系MCF-7和正常乳腺癌细胞系10A。同时发现BMP-2抑制剂Nogin以时间依赖的方式降低乳腺癌细胞系中p-p38和VEGF的表达;p38特异性抑制剂SB203580以剂量依赖的方式降低VEGF的表达。这说明BMP-2在乳腺癌中可能通过p38MAPK信号通路诱导了VEGF的下调。为了进一步说明这个问题,我们又做了细胞侵袭试验,结果发现加入p38特异性抑制剂SB203580、BMP-2特异性抑制剂Noggin后乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-435s侵袭细胞数均降低。综上所述,BMP-2在乳腺癌中可能通过p38信号通路诱导了VEGF的下降。我们的实验结果可能为p38MAPK信号通路作为乳腺癌治疗靶点提供了相应的理论依据。结论1、BMP-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌中表达并与淋巴结转移相关。2、BMP-2在乳腺癌中可能通过p38MAPK信号通路诱导VEGF的下调。